Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел - Корниенко И.В.
ISBN 5-7509-0904-2
Скачать (прямая ссылка):
Типичные значения для четырех длин волн для высокоочищенной ДНК приведены в таблице 7.
Таблица 7
Спектрофотометрические показатели препарата высокоочищенной ДНК тимуса теленка, растворенной в lxTNE буфере в концентрации 25 мкг/мл.
Длина Поглоще А-26о/ А-280 Концентрация
волны ние (мкг/мл)
(нм)
325 0,01 - -
280 0,28 - -
260 0,56 2,0 28
230 0,30 - -
23. Количественная оценка выделенной ДНК на флуориметре Hoefer DyNA Quant™ 200
ПРИНЦИП:
В присутствии ДНК у бисбензимида (общеизвестен как краситель Hoechst 33258 или Н 33258 (рис. 19)) изменяются параметры флуоресценции, интенсивность которой пропорциональна концентрации ДНК.
Рисунок 19. Химическая структура бисбензимида (Hoechst 33258).
ОБРАЗЕЦ:
Раствор ДНК, концентрацией 1-100 нг/мкл.
В отсутствие ДНК максимум поглощения и эмиссии Hoechst 33258 составляет 356 и 492 нм, соответственно. При взаимодействии Н 33258 с ДНК эти пики сдвигаются в область 365 нм (поглощение) и 458 нм (эмиссия). В кювете флуо-риметра комплекс ДНК и Н 33258 облучают ртутной лампой со световым фильтром на 365±7 нм.
Свет такой интенсивности возбуждает валентные электроны комплекса ДНК — Н 33258, вызывая развитие флуоресценции. Световой фильтр перед фотодетектором позволяет регистрировать эмиссию в области 460±15 нм. Таким образом, по интенсивности флуоресценции (по калибровочной кривой или по сравнению с образцом ДНК с известной концентрацией) можно определить концентрацию ДНК.
Спектрофотометрия растворов ДНК при длинах волн 260 и 280 нм дает некорректные результаты в присутствии РНК и белков, вследствие наложения их спектров. Hoechst 33258 связывается только с двухцепочечной ДНК, что позволяет корректно измерять концентрацию ДНК в присутствии белковых и РНКовых кон-таминантов.
С повышением концентрации детергентов флуоресценция усиливается. Конечная концентрация SDS должна быть ниже 0,01%, Тритона Х-100 — ниже 0,001%, других детергентов — ниже 10 мкг/мл. Флуоресценция одноцепочечной геномной ДНК примерно вполовину менее интенсивна по сравнению с двухцепочечной ДНК эквивалентной концентрации. Поэтому при измерении концентрации одноцепочечной ДНК стандартная ДНК тоже должна быть одноцепочечной. Если проба содержит высокий уровень белков, которые могут увеличивать уровень шумов, предварительная обработка пробы Протеи-назой К может снизить флуоресцентный фон.
Так как Н 33258 связывается с А —Т основаниями двойной спирали ДНК, интенсивность сигнала флуоресценции зависит не только от концентрации ДНК, но и от процентного содержания АТ в ней. Поэтому необходимо убедиться, что АТ-состав стандартной ДНК близок к таковому в биологическом объекте. Обычно при измерении ДНК эукариот, в которых АТ-состав колеблется от 56 до 60%, в качестве стандарта наиболее приемлема ДНК тимуса теленка с содержанием А —Т пар 58%. Ниже приведен процентный состав А —Т пар в ДНК некоторых организмов.
Источник AT %
двухцепочечной ДНК
Тимус теленка 58
Clostridium perfringens 73,5
Е. coli 50
Плацента человека 58
Micrococcus luteus 28
Если АТ-состав ДНК стандарта (АТст) и образца (АТобр) отличаются, то для расчета концентрации ДНК используется формула:
Концентрация ДНК в образце =
= Сст • (0,025 • (АТ% ст - АТ%обр) + 1).
Например, содержание АТ-пар в стандарте и образце составляет 40 и 50%, соответственно, а концентрация стандартной ДНК равна 100 нг/мл, тогда
Концентрация ДНК в образце = 100 •
• (0,025 • (40 - 50) + 1) =
= 2,5 • (-10) + 100 = 75 нг/мл.
1. Включить флуориметр Hoefer DyNA Quant™ 200 (рис. 20). Подождать 15 минут до стабилизации работы лампы.
2. Включить «Promt mode» off.
3. Поместить кювету оптическими окошками по направлению влево и к клавиатуре.
4. В микроцентрифужных пробирках приготовить различные разведения растворов ДНК.
5. К образцам ДНК добавить краситель Н 33258. Для этого пробу смешивают либо с 2Х С AS А (если концентрация ДНК в растворе <10 нг/мкл), либо с 2Х CAS В (если концентрация ДНК в растворе 10-100 нг/мкл) в соотношении 1:1.
6. Одновременно готовят одну холостую пробу — IX CAS, не содержащий ДНК, и раствор стандартной ДНК.
7. Капилляры заполнить смесью ДНК-краси-тель.
8. В кювету флуориметра поместить капилляр с холостой пробой. Закрыть крышку и нажать клавишу <ZERO> на панели
управления. После высвечивания на жидко-кристаллическом дисплее цифры «О», вынуть капилляр из кюветы.
ВЫКЛЮЧАТЕЛЬ
Жидко кристалический дисплей
Клавиатура
Кювета
Кнопка для извлечения кюветы
Рисунок 20. Общий вид флуориметра Hoefer DyNA
Quant™ 200.
9. В кювету флуориметра поместить капилляр с известной концентрацией ДНК. Закрыть крышку и нажать клавишу <CALIB>. С клавиатуры ввести стандартную концентрацию (в нг/мл) или концентрацию, рассчитанную по вышеприведенной формуле. Нажать <ENTER>. Вынуть капилляр из кюветы.
