Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел - Корниенко И.В.
ISBN 5-7509-0904-2
Скачать (прямая ссылка):
20. Центрифугировать при 3000 об/мин. 20 минут.
21. Максимально отобрать верхнюю (бута-нольную) фазу автоматической пипеткой или стерильной бумажной салфеткой типа Кимвайп.
22. Дальнейшую очистку от ингибиторов и концентрацию раствора ДНК проводят с использованием устройства — концентратора Centricon 100.
23. Оценить количество и качество выделенной ДНК при помощи электрофореза в
0,8-1% агарозном геле. Записать полученный результат.
24. Водный раствор ДНК хранить при температуре + 4°С в течение 3-х недель, при
— 70°С неограниченно долго. Во избежании разрушения молекул ДНК свободными радикалами, хранение водных растворов ДНК при — 20°С нежелательно.
11. Выделение ДНК из тканей зуба методом экстракции органическими реагентами
ПРИНЦИП:
Экстракция ДНК из зуба включает в себя лизис ядерных клеток в присутствии додецил сульфата натрия и протеиназы К, дальнейшую
очистку от белков фенолом, очистку от ингибиторов и концентрирование раствора ДНК с использованием концентратора Centricon 100.
ОБРАЗЕЦ:
неповрежденный зуб с корнем.
1. Зубы содержат сравнительно малое количество ДНК. Все этапы экстракции должны проводиться особо тщательно. Резиновые перчатки следует менять перед каждой новой экстракцией. В одно и тоже время обрабатывать только один образец.
2. Взвесить образец зуба, записать вес.
3. Чистый образец поместить в 50 мл коническую пробирку, содержащую приблизительно 25 мл стерильной дистиллированной воды. Плотно закрыть крышку и приблизительно 10 раз встряхнуть.
4. Декантировать воду. Повторить дважды.
5. Добавить 96% этанола так, чтобы спирт покрыл образец. Пробирку плотно закрыть крышкой, встряхнуть не менее 10 раз. Спирт декантировать.
6. Подписать емкость для взвешивания, затем обработать ее 7 мМ NaOCl и 96% этанолом.
7. Поместить образец на чистую, подписанную емкость для взвешивания и дать ему высохнуть на воздухе.
8. Используя режущий диск (аналог зубоврачебному), осторожно резать по середине зуба, отделить коронку от корня.
9. Убрать всю видимую пульпу из половинки зуба, используя или пару щипцов, или специальную ложечку.
10. Пульпу поместить в чистую, подписанную микроцентрифужную пробирку.
11. В пробирку с пульпой добавить 600 мкл ли-зирующего буфера (убедиться, что лизи-рующий буфер гомогенен) и 40 мкл про-теиназы К (10 мг/мл). Тщательно перемешать.
12. Инкубировать в течение 12-14 часов в термошейкере при 5б°С.
13. Добавить 600 мкл смеси фенол/хлоро-форм/изоамилового спирта (25:24:1). Тщательно перемешать.
14. Центрифугировать 2 минуты при 10000-15000 об/мин. на микроцентрифуге.
15. Перенести верхнюю водную фазу (осторожно, не задевая интерфазы) в стерильную микроцентрифужную пробирку.
16. пп. 13-15 повторить, до тех пор, пока интерфаза не станет чистой.
17. К верхней водной фазе, добавить 600 мкл бутанола. 5 секунд встряхивать на вортексе. Центрифугировать при 10000-15000 об/мин. в течение 2 минут.
18. Максимально отобрать автоматической пипеткой верхнюю (бутанольную) фазу.
19. Дальнейшую очистку от ингибиторов и концентрацию раствора ДНК проводят с
использованием устройства — концентратора Centricon 100.
20. Оценить количество и качество выделенной ДНК при помощи электрофореза в
0,8-1% агарозном геле. Записать получен-
I ный результат.
21. Водный раствор ДНК хранить при температуре + 4°С в течение 3-х недель, при — 70°С неограниченно долго.
Литература
1. Hochmeister M.N., Budowle В., Borer U.V., Eggmann U., Comey C.T., Dirnhofer R. Typing of deoxyribonucleic acid (DNA) extracted from compact bone from human remains // J. Forensic Sciences. — 1991. — Vol. 36. — P. 1649-1661.
2. Holland M.M., Fisher D.L., Mitchel L.G., Rodriguez W.C., Canik J.J., Merril C.R., Weedn V.W. Mitochondrial DNA sequence analysis of human skeletal remains: identification of remains from Viethnam War // J. Forensic Sciences. — 1993. — Vol. 38. — P. 542-553.
3. Ancient DNA: recovery and analysis of genetic material from paleontological, archaeological, museum, medical, and forensic specimens. Eds. Herrmann B., Hummel S. New York, Berlin: Springer, 1994, 264 p.
4. Гистология. Под ред. Елисеев В.Г., Афанасьев Ю.И., Юрина НА. М.: Медицина, 1983. —
I 592 с.
¦
I
5. Микроскопическая техника: Руководство.
Под ред. Саркисов Д.С., Перов Ю.Л. М.: Медицина, 1996. — 544 с.
6. Елисеев В.Г., Афанасьев Ю.И., Котовский Е.Ф. Атлас микроскопического и ультрамикро-скопического строения клеток, тканей и органов. М.: Медицина, 1970. — 400 с.
7. Березовский В.А., Колотилов Н.Н. Биофизические характеристики тканей человека. Справочник. Киев: Наукова Думка, 1990.— 224 с.
8. DNA Procedures Manual. Extraction of DNA from dried skeletal remains. Ver.3.0 // Armed Forces Institute of Pathology, DNA Identification Laboratory. — Washington, 1996, P. 1-10.
9. Forensic Biology: DNA Procedures Manual. Isolation of DNA from bone. Ver. 2.0 // Illinois State Police, FB-IIIA-8, 1997, P. 1-3.
