Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел - Корниенко И.В.
ISBN 5-7509-0904-2
Скачать (прямая ссылка):
Волос стерильным пинцетом погрузить в деионизированную воду. Каждый волос необходимо промывать только в отдельной мензурке.
Волос промыть в растворе 96% этанола, просушить.
3. После высушивания очень осторожно, над стерильной 1,5 мл пробиркой, отрезать луковицу волоса с 2 — 3 мм стержня.
4. В пробирку с фрагментом волоса внести 200 мкл 5 % взвеси ионообменной смолы Chelex 100. Когда отбирают Chelex, взвесь должна быть однородной. Для этого во время отбора Chelex перемешивают на магнитной мешалке. Использовать наконечники к автоматическим пипеткам с широким отверстием.
5. Добавить 2 мкл протеиназы К (10 мг/мл). Осторожно перемешать.
6. Инкубировать при +56°С, по крайней мере, 6-8 часов (лучше оставить на 12-14 часов).
7. Перемешивать на вортексе в течение 5-10 секунд.
8. Центрифугировать на микроцентрифуге 20 секунд при 15000 об/мин. при комнатной температуре.
9. Пробирку с лизатом инкубировать на кипящей водяной бане в течение 8 минут. Перед кипячением проверить, чтобы Волос был полностью погружен в раствор.
10. Перемешивать на вортексе в течение 5-10 секунд на максимальной скорости.
11. Центрифугировать на микроцентрифуге
3 минуты при 15000 об/мин. при комнатной температуре. Супернатант используют для постановки реакции ПЦР.
12. Остатки супернатанта хранят при температуре 2 - 8°С или при -20°С (длительное хранение).
13. При повторном использовании производят действия, указанные в пп. 13-14.
Литература
1. Higuchi R., von Beroldingen С.Н., Sensabaugh G.F., Erlich H.A. DNA typing from single hairs // Nature. — 1988. — Vol. 332. — P. 543-546.
2. Hbhne J.r Pfeiffer H., Waterkamp K., Brink -mann B. Mitochondrial DNA in human hair shafts — existence of intra-individual differ-
ences? // Int. J. Legal Med., 1999.— Vol. 112. — P. 172-175.
3. Заяц M.B., Иванов П.Л. Опыт использования волос в качестве объекта исследования в судебно-медицинской молекулярно-генетической экспертизе // Судебно-медицинская экспертиза, 1997. — № 1. — С. 17-24.
4. Лебедева И.А., Куликов Е.Е., Иванова Н.В., Полтараус А.Б. Определение нуклеотидных последовательностей митохондриальной ДНК в стержнях волос при длительных сроках их хранения // Судебно-медицинская экспертиза, 2000. — № 3. — С. 9-14.
5. AmpFlSTR Profiler Plus PCR Amplification Kit. User's Manual. Applied Biosystems, 1998. — P. 3.1-3.41.
6. Kirby L.T. DNA Fingerprinting: an Introduction. New York: Stockton Press, 1992, 366 p.
7. Туманов A.K. Основы судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств. М.: Медицина, 1975. — 408 с.
8. Барсегянц Л.О. Судебно-медицинское исследование вещественных доказательств (кровь, выделения, волосы): Руководство для судебных медиков. — М.: Медицина, 1999. - 272 с.
9. Хэм А., Кормак Д. Гистология. В 5-ти томах. Т. 4. М.: Мир, 1983. - 245 с.
10. Афанасьев Ю.И., Юрина Н.А., Алешин Б.В., Винников Я.А., Катинас Г.С., Котовский Е.Ф., Радостна А.И., Торбек В.Э., Ченцов Ю.С.
Гистология, цитология и эмбриология. М.: Медицина, 1999. — 744 с.
11. Елисеев В.Г., Афанасьев Ю.И., Котовский Е.Ф. Атлас микроскопического и ультрамик-роскопического строения клеток, тканей и органов. М.: Медицина, 1970. — 400 с.
12. Tahir М.А., Watson N. Typing of DNA HLA-DQ alleles extracted from human nail material using polymerase chain reaction // J. Forensic Sci., 1995. - Vol. 40. - P. 622-624.
13. DNA Procedures Manual. Extraction of DNA from dried skeletal remains. Ver.1.0 // Armed Forces Institute of Pathology, DNA Identification Laboratory. — Washington, 1997, P. 1-6.
14. Anderson T.D., Ross J.P., Lee D.A., Roby R.K., Canik J.J., Holland M.M. A validation study for the extraction and analysis of DNA from human nail material and its application to forensic casework // J. Forensic Sci., 1999.
15. AmpliType™ User Guide, Version 2; Cetus Corporation: Emeryville, CA; 1990.
16. Higuchi R., Beroldingen C.H., Sensabaugh G.F., Erlich H.A. DNA typing from single hairs / Nature, 1988. — Vol. 332, № 6164, pp. 543-546.
17. Wilson M.R., Polanskey D., Butler J., DiZinno J.A., Replogle J., Budowle B. Extraction, PCR amplification and sequencing of mitochondrial DNA from human hair shafts // BioTechniques, 1995. - Vol. 18. - P. 662-669.
18. Hopgood R., Sillivan K.M., Gill P. Strategies for automated sequencing of human mitochondrial
DNA directly from PCR products // BioTech-niques, 1992. — Vol. 13. — P. 82-92.
19. Salas A., Lareu M.V., Carracedo A. Hetero-plasmy in mtDNA and the weight of evidence in forensic mtDNA analysis: a case report // Int. J. Legal Med., 2001. — Vol. 114. — P. 186-190.
20. AmpFlSTR Profiler Plus PCR Amplification Kit. User's Manual. Applied Biosystems, 1998. — P. 3.1-3.41.
IV. МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ ФРАГМЕНТОВ ХРЯЩА, СУХОЖИЛИЙ
И МЯГКИХ ТКАНЕЙ
При проведении молекулярно-генетической идентификации в лаборатории молекулярнобиологических исследований 124 ЦЛМКИ МО РФ доля трупного материала, представленная сухожилиями, хрящами и мышечными тканями составляет 1,5-2%, 6% и 20% соответственно. Данные ткани содержат достаточное количество ДНК, так, например, мышцы и кожа содержат до 3 мкг ДНК в одном миллиграмме ткани.
