Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел - Корниенко И.В.
ISBN 5-7509-0904-2
Скачать (прямая ссылка):
ПРИНЦИП:
Процедура включает в себя этапы выделения ДНК из пятен крови с использованием органических растворителей. В основе метода лежит лизис ядерных клеток додецил сульфатом натрия. Лизат очищают смесью фенол/хлоро-форм/изоамиловый спирт. ДНК получают преципитацией с использованием холодного этанола, а затем растворяют в трис-ЭДТА (ТЕ) буфере.
ОБРАЗЕН:
Пятно крови диаметром 1-5 мм.
1. Стерильными ножницами отделить фрагмент пятна крови (диаметром 1-5 мм или, если необходимо, больше) на маленькие кусочки и поместить их в подписанную стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
2. Добавить 400 мкл лизирующего буфера и 20 мкл протеиназы К (10 мг/мл). Осто-
рожно перемешать, центрифугировать 1 секунду при 5000 об/мин.
3. Инкубировать 12-14 часов в термошейкере при температуре +56°С.
4. Добавить 400 мкл смеси фенол/хлоро-
форм/изоамилового спирта (25:24:1). Тщательно перемешать. Центрифугировать две минуты при 10000-15000 об/мин. Перенести верхнюю водную фазу (не затрагивая интерфазу) в стерильную
микроцентрифужную пробирку.
5. Повторить п. 4, до тех пор, пока интерфаза не станет чистой.
6. К водной фазе добавить 1,0 мл холодного 96% этанола. Осторожно перемешать.
7. Инкубировать при — 20°С не менее 30 минут.
8. Центрифугировать 15 минут при 15000 об/мин. (лучше всего в рефрижераторной центрифуге при — 20°С).
9. Удалить этиловый спирт декантацией или автоматической пипеткой (осторожно не задевая осадок).
10. Добавить 1 мл охлажденного 70% раствора этанола.
11. Центрифугировать 5 минут при 15000 об/мин.
12. Супернатант удалить.
13. Осадок сушить при комнатной температуре в течение 30-60 минут.
14. К осадку ДНК добавить 50 мкл ТЕ буфера. Инкубировать при 56°С в течение не менее 2-х часов.
15. Оценить количество и качество выделенной ДНК при помощи электрофореза в
0,8-1% агарозном геле. Записать получена ный результат.
16. Выделенную ДНК хранить при +4°С в течение 3-х недель, либо при — 70°С неограниченно долго.
8. Выделение ДНК из жидкой крови
методом нуклеосорбции
ПРИНЦИП МЕТОДА:
Гуанидинизотиоционат является очень сильным денатурирующим агентом, который используется для одновременного лизиса клеток и денатурации всех клеточных белков. В основе метода лежит лизис ядерных белых клеток крови и сорбция молекул ДНК на сорбенте Si02.
ОБРАЗЕЦ:
50 мкл цельной крови.
1. В стерильную пробирку типа Эппендорф, объемом 1,5 мл вносят 900 мкл лизирую-щего буфера с гуанидинтиоционатом (ЛБГ) и 40 мкл суспензии сорбента Si02, перед использованием встряхнуть на вортексе. Полученную суспензию можно хранить в течение недели.
2. В суспензию внести 50 мкл крови, 5 секунд встряхивать на вортексе.
3. Инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут.
4. В течение 5 секунд встряхивать на вортексе.
5. Центрифугировать 15 секунд при 10000-15000 об/мин.
6. Супернатант удалить в сосуд с 10 М NaOH (не допускать разбавления щелочи ниже
0,3 М), тем самым нейтрализуя HCN, образующуюся при контакте гуанидинтио-ционата с кислотами.
7. К осадку сорбента добавить 0,8-1 мл отмывающего раствора с гуанидинтиоциона-том (ОРГ). Встряхнуть на вортексе.
8. Центрифугировать 15 секунд при 10000-15000 об/мин.
9. Супернатант автоматической пипеткой перенести в сосуд с 10 М NaOH.
10. пп. 7-9 повторить еще раз.
11. К осадку сорбента добавить 0,8-1 мл 70% водного раствора этанола. Встряхнуть на вортексе.
12. Центрифугировать 15 секунд при 10000-15000 об/мин.
13. Супернатант автоматической пипеткой перенести в сосуд с 10 М NaOH.
14. пп. 11-13 повторить еще раз.
15. К осадку сорбента добавить 0,8-1 мл ацетона. Встряхнуть на вортексе.
16. Центрифугировать 15 секунд при 10000-15000 об/мин. Супернатант удалить.
17. После удаления ацетона пробирки с открытыми крышками поместить в микротермостат на + 56°С.
18. Инкубировать в течение 10 минут.
19. К осадку сорбенту добавить 50-75 мкл ТЕ-
элюирующего буфера (ЭБ). Встряхнуть на вортексе. )
20. Инкубировать при температуре + 5б°С в течение 10 минут.
21. Встряхнуть на вортексе.
22. Центрифугировать 2 минуты при 10000-15000 об/мин. Супернатант содержит ДНК и пригоден для постановки ПЦР.
Литература
1. Томилин В.В., Гладких А.С. Судебно-медицинское исследование крови в делах о спорном отцовстве, материнстве и замене детей. М.: Медицина, 1981. — 240 с.
2. Хэм А., Кормак Д. Гистология. В 5-ти томах. Т. 2. М.: Мир, 1983. — 254 с.
3. Гистология. Под ред. Елисеев В.Г., Афанасьев Ю.И., Юрина Н.А. М.: Медицина, 1983. — 592 с.
4. Абрамов М.Г. Гематологический атлас. М.: Медицина, 1979. — 280 с.
5. Хмелевский Ю.В., Усатенко O.K. Основные биохимические константы человека в норме
и при патологии. Киев: Здоров'э, 1984. — 120 с.
6. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник. Под ред. Меньшикова В.В. М.: Медицина, 1987. — 368 с.
7. Березовский В.А., Колотилов Н.Н. Биофизические характеристики тканей человека. Справочник. Киев: Наукова Думка, 1990. — 224 с.
