Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел - Корниенко И.В.
ISBN 5-7509-0904-2
Скачать (прямая ссылка):
Таблица 5
Цвет, средняя длина, средний диаметр и процент успешных амплификаций по локусу HV1 (16024-16365) человеческой мтДНК. Материал по 15 волосьев от 10 индивидуумов [по Hbhne J. et al., 1999]
Пер 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
сона
Цвет ры кори тём- свет бе тёмно бе свет се ко-
волос жий чне но- ло- лый корич лый ло- рый рич-
вый кори кори невый кори нево-
чне- ч не- чне- ры-
вый вы й вый жие
Сред 15 10 14 И 8 12 15 9 5 5
няя
длина,
см
Сред 0,07 0,09 0,08 0,06 0,06 0,09 0,07 0,08 0,08 0,1
ний
диа
метр,
мм
Про 53 93 87 53 33 87 53 53 60 100
цент
успешн.
ампли
фика
ций по
HV1
Как видно из таблицы 5, процент успешных амплификаций митохондриальных маркеров не зависит от д/шны волоса. С другой стороны,
предварительная обработка волос красителями и шампунями также не влияет на успех амплификации.
Ноготь — плотная роговая пластинка, лежащая на ногтевом ложе. Ногтевая пластинка подразделяется на корень, тело и край. Корнем ногтя называется задняя часть ногтевой пластинки, лежащая в задней ногтевой щели (рис. 15). Свободный конец ногтевой цластинки, выступающий за пределы ногтевого ложа называется краем ногтя. Ногтевая пластинка образована плотно прилегающими друг к другу роговыми чешуйками.
Рисунок 15. Строение ногтя (по Афанасьеву Ю.И., Юриной Н.А. и др., 1999).
1 — ногтевая пластинка; 2 — подногтевая пластинка (ростковый и шиповатый слой эпидермиса); 3 — сосочковый слой дермы; 4 — ногтевое ложе; 5 — задний ногтевой валик; 6 — ногтевая матрица; 7 — соединительные волокна; 8 — кость фаланги пальца.
Ногтевое ложе состоит из соединительной ткани и эпителия, представленного ростковым слоем эпидермиса. Участок эпителия ногтевого ложа, на котором лежит корень ногтя, является местом его роста, где постоянно происходят процесс размножения и ороговения клеток. Следовательно, данный участок наиболее богат ядерной и митохондриальной ДНК.
Ниже приведены методы выделения ДНК из ногтевой пластинки и волоса.
12. Выделение ДНК из ногтевой пластинки методом органической экстракции
ПРИНЦИП:
Процедура включает этапы экстракции ДНК из корневой зоны ногтевой пластинки. Экстракция ДНК включает в себя лизис ядерных клеток в присутствии додецил сульфата натрия и про-теиназы К. Для повышения эффективности экстракции ДНК в клеточный лизат вводят дополнительно реагенты-тиовосстановители, например, дитиотрейтол, который разрушает дисульфид-ные белковые сшивки, облегчая тем самым работу протеиназе К. Дальнейшую очистку от белков фенолом, очистку от ингибиторов и концентрирование раствора ДНК с использованием устройства — концентратора Centricon 100.
ОБРАЗЕЦ:
Ногтевая пластинка.
1. Обработку ногтя необходимо проводить в стерильных резиновых перчатках. Ногтевую пластинку стерильными ножницами или стерильным лезвием разделить на крупные фрагменты.
2. Фрагменты ногтевой пластинки поместить в стерильную 1,5 мл пробирку типа Эп-пендорф.
3. В пробирку с образцом добавить 1 мл 7 мМ раствора NaOCl деионизованной воды. Перемешивать в течение 2 минут. Удалить NaOCl.
4. Если ноготь покрыт лаком, добавить 1 мл ацетона. Встряхивать на вортексе 2 минут. Удалить ацетон.
5. Добавить 1 мл стерильной деионизованной воды. Перемешивать в течение 2 минут. Удалить воду. Повторить до тех пор, пока поверхность ногтя не станет чистой.
6. Добавить 1 мл 10% SDS. Обработать ультразвуком (мощностью 40 Вт) в течение 10 мин. Удалить SDS.
7. Добавить 1 мл 7 мМ NaOCl. Перемешивать в течение 2 минут. Удалить NaOCl.
8. Добавить 1 мл стерильной деионизованной воды. Тщательно прополоскать образец. Удалить воду. Повторить 3 раза.
9. Добавить 1 мл стерильной деионизованной воды. Кипятить 5 минут (если ноготь свежий) или 20 минут (если ноготь старый).
10. Измельчить ногтевые фрагменты стерильными ножницами или стерильным лезвием и перенести в стерильную, подписанную микроцентрифужную пробирку.
