Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел - Корниенко И.В.
ISBN 5-7509-0904-2
Скачать (прямая ссылка):
11. Добавить 500 мкл лизирующего буфера, 20 мкл 1М ДТТ и 25 мкл протеиназы К (10 мг/мл).
12. Инкубировать 3 часа (12-14 часов) в тер-мошейкере при 56°С.
13. Если ногтевые фрагменты полностью не растворились, добавить 20 мкл 1 М ДТТ и
25 мкл протеиназы К (10 мг/мл). Инкубировать приблизительно 3 часа в термо-шейкере при 56°С.
14. Повторять до тех пор, пока ногтевые фрагменты полностью не растворятся или максимум 5 раз.
15. Добавить 500 мкл смеси фенол/хлоро-форм/изоамиловый спирт (25:24:1). Тщательно перемешать.
16. Центрифугировать 5 минут при 12000 об/мин.
17. Перенести верхнюю водную фазу в стерильную микроцентрифужную пробирку. Повторить, до тех пор, пока интерфаза не станет чистой.
18. Добавить 500 мкл бутанола. Тщательно перемешать.
19. Центрифугировать 5 минут при 12000 об/мин.
20. Тщательно удалить верхнюю фазу (бута-нол).
21. Дальнейшую очистку от ингибиторов и концентрацию раствора ДНК проводят с использованием устройства — концентратора Centricon 100.
22. Оценить количество и качество выделенной ДНК при помощи электрофореза в
0,8-1% агарозном геле. Записать полученный результат.
23. Выделенную ДНК хранить при +4°С в течение 3-х недель, либо при — 70°С неограниченно долго.
13. Выделение ДНК из волоса методом экстракции органическими реагентами
ПРИНЦИП:
Процедура включает в себя этапы выделения ДНК из волоса с использованием органических растворителей. Основной этап состоит из лизиса клеток и деградации белковых молекул экстракционным (лизирующим) буфером, содержащим дитиотрейтол и протеиназу К. После лизиса следует депротеинизация образца смесыо фенол/хлороформ/изоамиловый спирт. Очистку от ингибиторов и концентрирование раствора ДНК с использованием устройства — концентратора Centricon 100.
ОБРАЗЕЦ:
Для исследования используют все варианты волос, в том числе и волосы, не имеющие луковичной части. При отсутствии луковичной части волоса исследуют прикорневую часть стержня волоса длиной не менее 3 см и не более 10 см.
1. Стерильным пинцетом перенести волос на предметный столик микроскопа для оценки наличия эпителиальных клеток влагалища и волосяной сумки. Обратить внимание на присутствие на волосе биологических жидкостей.
2. Непосредственно перед выделением ДНК необходимо подготовить 50 мл стерильные мензурки (колбы или пробирки), заполнить стерильной деионизированной водой.
3. Волос стерильным пинцетом погрузить в деионизированную воду. Каждый волос необходимо промывать только в отдельной мензурке.
4. Волос промыть в растворе 96% этанола, просушить.
5. После высушивания — волос разделить ножницами на фрагменты длиной около 1 см, которые помещают в 1,5 мл пробирку типа Эппендорф.
6. В пробирку с волосом добавить 500 мкл лизирующего буфера, 20 мкл 1 М ДТТ и 15 мкл раствора протеиназы К.
7. Инкубировать при температуре + 56°С в течение 6-8 часов. В процессе выдерживания — волос частично растворяется.
8. После инкубации содержимое пробирки перемешать на вортексе в течение 30 секунд.
9. Затем к лизату добавить 20 мкл 1 М ДТТ и 15 мкл раствора протеиназы К.
10. Инкубировать при температуре +56°С в течение 6-8 часов, после чего волос полностью растворяется.
11. Содержимое пробирки перемешать на вортексе в течение 30 секунд при средней скорости.
12. Центрифугировать 1 минуту при 10 000 — 15 000 об/мин. После центрифугирования продукты лизиса волоса переходят в супернатант.
13. Супернатант отбирать в чистую 1,5 мл пробирку.
14. Добавить 600 мкл смеси фенол/хлоро-форм/изоамиловый спирт (25:24:1). Перемешать на вортексе в течение 15 секунд.
15. Центрифугировать 10 минут при 15 000 об/мин.
16. Верхнюю водную фазу переносят в чистую пробирку типа Эппендорф.
17. Добавить 500 мкл водонасыщенного н-бутанола с целью удаления остатка фенол/хлороформа, который может повредить мембрану Centricon-100.
18. Перемешать на вортексе 15 секунд.
19. Центрифугировать 1 минуту при 10000 об/мин. Водная фаза, содержащая ДНК, собирается на дне пробирки, верхний слой — удалить.
20. Дальнейшую очистку от ингибиторов и концентрацию раствора ДНК проводить с использованием устройства — концентратора Centricon 100.
21. Выделенную ДНК хранить при +4°С в течение 3-х недель, либо при — 70°С неограниченно долго.
14. Выделение ДНК из волоса с помощью ионообменной смолы Chelex 100 и протеиназы К
ПРИНЦИП:
Основная процедура выделения включает в себя инкубацию волоса с протеиназой К и Chelex 100. Очистку от протеинов и ингибиторов ПЦР проводят путем кипячения образца в присутствии Chelex 100. Лизат непосредственно добавляют в ПЦР смесь.
ОБРАЗЕЦ:
фрагмент корневой зоны длиной 5-10 мм.
1. Стерильным пинцетом перенести волос на предметный столик микроскопа для оценки наличия эпителиальных клеток влагалища и волосяной сумки. Обратить вни-
мание на присутствие на волосе биологических жидкостей.
2. Волос отмывают от поверхностной грязи и возможных контаминантов следующим образом.
Непосредственно перед выделением ДНК необходимо подготовить 50 мл стерильные мензурки (колбы или пробирки), заполнить стерильной деионизированной водой.
