Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
Прежде чем перейти к детальному описанию методов культивирования в суспензии и в монослое и соответствующего оборудования, остановимся на некоторых общих аспектах культивирования клеток, многие из которых существенны для обеих систем.
2. Общие методы и параметры культур
Для увеличения размера клеточных культур необходимо знакомство с некоторыми биологическими концепциями и методами. При работе с небольшими культурами сохраняется известная «свобода для ошибок». Если культура погибнет, это будет досадно, но не катастрофично с точки зрения потери времени и денег. По мере того как масштаб культуры увеличивается, для ее поддержания требуется все больше ресурсов. Гибель культуры становится все более серьезным событием, и одновременно растут требования системы к более точному соблюдению всех условий культивирования. В этом разделе будет приведено описание всех главных компонентов систем культивирования клеток, на которые следует обращать особое внимание при увеличении масштабов культур и разнообразия конструкций и способов управления.
2.1. Определение количества клеток
Методы определения общего количества клеток (путем подсчета в гемоцитометре целых клеток или окрашенных ядер) и общей клеточной массы (путем определения сухого веса или количества белка) нетрудны. Сложнее получить правильное представление о жизнеспособности клеток, поскольку принятые методы либо повреждают клетки, либо используют специфические, но не обязательно типичные параметры физиологии клетки (см. гл. 8). Дополнительные трудности создаются тем, что во многих системах культивирования нельзя осуществить отбор проб (большинство культур клеток, зависящих от субстрата) или визуальное наблюдение, так что приходится прибегать к непрямым измерениям.
2.1.1. Жизнеспособность клеток
Исключение красителя. Метод основан на том, что живые клетки не могут захватывать некоторые красители, тогда как мертвые клетки проницаемы для них. Наиболее распространен-
ным красителем такого рода является трипановый синий (0,4%), но к числу его недостатков следует отнести способность окрашивать растворимые белки. Если клетки растут в среде с сывороткой, лучше использовать эритрозин В (0,4%) (см. гл. 4). Подсчет окрашенных и неокрашенных клеток проводится стандартным образом в гемоцитометре. Следует быть осторожным при интерпретации результатов, если окрашивание зависит от pH и концентрации; известны ситуации, при которых могут быть получены ложные результаты. Например, проницаемость мембран увеличивается в результате обработки клеток трипсином или при оттаивании замороженных клеток в присутствии диметилсульфоксида. Более подробно проблема определения жизнеспособности клеток будет рассмотрена в гл. 4 и 8.
Непрямые измерения жизнеспособности клеток основаны на оценке их метаболической активности. Наиболее часто используемым параметром является утилизация глюкозы, а в качестве других параметров жизнеспособности могут быть также использованы поглощение кислорода, образование молочной и пировиноградной кислот, а кроме того, экспрессия ферментов. При логарифмическом росте клеток наблюдается очень тесная корреляция между утилизацией питательных веществ и числом клеток. Однако на других фазах роста культуры высокая скорость обмена, связанная не с ростом клеток, а с их жизнедеятельностью, может привести к получению ложных результатов. Результаты проведенных измерений можно выражать в форме выхода биомассы (Y) или в форме отношения удельной утилизации к скорости дыхания (Q):
Типичные значения выхода биомассы для глюкозы (106 кле-ток/г) составляют 385 для клеток MRC-5, 620 для клеток Vero и 500 для клеток ВНК.
2.1.2. Непрямые измерения
Удельная утилизация/ скорость дыхания
Выход биомассы (Y)
Концентрация биомассы (DX) Концентрация субстрата (DS) Концентрация субстрата (DS)
(Q)
2.2. Оборудование и реагенты
2.2.1. Культуральные сосуды и их поверхности
Стандартным материалом многократного использования для выращивания животных клеток является стекло, хотя в более крупных культуральных сосудах оно заменяется на нержавею-
щую сталь. Предпочтительнее использовать боросиликатные стекла (например, пирекс), поскольку они выщелачиваются слабее, чем натриевые. Главное, чтобы стеклянная посуда была чисто вымыта и по крайней мере трижды ополоснута деионизированной водой. Клетки легко прикрепляются к стеклу, но прикрепление может быть усилено при различных обработках поверхности (см. разд. 3.1). В суспензионной культуре прикрепление клеток нежелательно; для этого поверхности культуральных сосудов обрабатываются силиконовыми препаратами. Примерами могут служить Dow Corning 1107 (который прочно связывается со стеклом при нагревании) или диметилдихлор-силан (Repelcote, Hopkins and Williams), обработка которым требует последующего тщательного промывания сосудов в дистиллированной воде для удаления трихлорэтанового растворителя.
2.2.2. Соединительные трубки
