Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
ных веществ, пространственные ограничения и механический стресс.
Как только один из этих факторов вступает в действие, рост клеток прекращается и ресурсы системы остаются неиспользованными. Поэтому задачей исследователя является задержка вступления в силу любого из этих факторов до тех пор, пока рост культуры не прекратится сам по себе. Приведем примеры путей достижения оптимального роста клеток: улучшение буферной системы (например, использование буфера HEPES
Логарифм
числа
клеток
Рис. 3.2. Фазы роста культуры. I — лаг-фаза; II — фаза логарифмического роста; III — стационарная фаза; IV — фаза снижения количества клеток и
гибель их.
вместо бикарбонатного); постоянный искусственный газообмен; увеличение свободного объема; использование вместо минимальных сред сложных сред с резервными добавками, такими как гидролизат лактальбумина, пептон и т. д.; введение перфу-зионных контуров, особенно с волокнистыми фильтрами и диализными трубками для детоксикации и т. д.
2.4. Кинетика роста
Стандартная кривая роста культуры начинается с лаг-фазы, за которой следуют фаза логарифмического роста, стационарная фаза и фаза снижения количества и гибели клеток (рис. 3.2). Такой характер роста подтвержден результатами многих исследований ,(см. гл. 1). Термин «рост клеток» обычно относят к увеличению их количества, хотя увеличение клеточной массы может происходить без репликации клеток. Различия в средней массе клетки оказываются весьма значительными при сравнении различных клеточных популяций, однако и в рамках одной популяции величина средней массы клетки может варьировать.
Рост (увеличение числа или массы клеток) может быть определен с помощью следующих выражении:
а) Удельная скорость роста (|я; скорость роста на единицу количества (веса или числа клеток) биомассы)
[г = (1 /х) (dx/dt) h~1 (3)»
где dx — увеличение массы клеток, dt — интервал времени и х — масса клеток.
Если скорость роста постоянна (например, в фазе логарифмического роста), то тогда
lnx=lnx0 + [it (4).
где х0 — вес биомассы в момент времени to.
б) Время удвоения (td); время, в течение которого происходит удвоение численности или массы популяции:
td = In 2/[i= 0,693/[i (5);
в) Скорость размножения (п) или число удвоений (т. е. количество случаев репликации инокулята)
п = 3,32 log (х/х0). (6)(
2.5. Среда и питательные вещества
Данная концентрация питательных веществ может поддерживать существование только определенного количества клеток. При истощении того или иного питательного вещества клетки-часто могут использовать другие вещества, но на практике такой путь используется редко, поскольку он всегда сопровождается снижением скорости роста (например, при индукции альтернативных ферментов). Если минимальные среды, такие как МЕМ или основная базальная среда Игла, используются с сывороткой в качестве единственной добавки, то проблема истощения возникает скорее, чем при использовании полных сред (например, среды 199) или сред с добавками гидролизата лак-тальбумина, пептона или БСА (сред, включающих многие жирные кислоты). К питательным веществам, истощающимся в* первую очередь, относится глутамин, частично вследствие его спонтанной циклизации до пирролидоновой карбоновой кислоты, а также в результате ферментативного превращения (ферментами сыворотки и клетск) в глутаминовую кислоту, лейцин и изолейцин. Диплоидные клетки человека почти уникальны по интенсивной утилизации цистина. Многочисленные публикации об аргинине как лимитирующем факторе, по-видимому,, ошибочны вследствие частого загрязнения клеток микоплазмой. Напомним, что то или иное питательное вещество перед истощением начинает тормозить рост клеток. По мере снижения концентрации аминокислот клеткам становится все труднее-поддерживать достаточный внутриклеточный пул. Проблема!
особенно обостряется в монослойной культуре, поскольку по мере увеличения плотности клеток в монослое снижается свободная поверхность клеток, доступная для вхождения питательных веществ [1].
Глюкоза часто оказывается другим лимитирующим фактором по мере ее катаболической утилизации клетками. Так что вместо добавления высоких концентраций глюкозы в начале культивирования предпочтительнее добавлять ее через 2—3 дня культивирования. Для поддержания в культуре некоторого
Рис. 3.3. Сравнение роста клеток MRC-5 при постоянной перфузии (А) или полных сменах среды (Б). В обеих системах использовался один и тот же объем сменяемой среды за сутки. Рост клеток представлен в эквивалентах монослоя (ЭМ); этим подчеркиваетси многослойный рост клеток MRC-5.
избытка питательных веществ нередко используется частичная или полная смена среды путем перфузии. На рис. 3.3 приведены результаты сравнительного анализа стимуляции роста клеток MRC-5 при добавлении одинаковых количеств среды либо путем постоянной перфузии (в течение 24 ч), либо путем смены среды. Эффективность смены среды обусловлена, по-видимому, создаваемыми при этом высокими внеклеточными концентрациями питательных веществ, стимулирующих последующие репликативные циклы. Как следует из этих данных, при использовании перфузии нужно быть уверенным, что скорость перфузии достаточно велика для оптимальных условий культивирования.
