Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
а) Прерывистый (при этом определенная часть культуры заменяется равным объемом свежей среды).
б) Постоянный (объем культуры увеличивается с постоянной низкой скоростью, а небольшие порции клеток периодически удаляются).
в) Перфузионный (осуществляется постоянное поступление свежей среды в культуру и одновременное удаление равного объема использованной (бесклеточной) среды). Перфузия может быть открытой, когда из системы удаляется вся среда, и закрытой, когда удаляемая из культуры среда проходит через дополнительный сосуд и возвращается в культуральный сосуд. Дополнительный сосуд используется для «регенерации» среды путем ее аэрации и доведения pH.
Все системы непроточных культур характеризуются в той или иной степени накоплением отходов и непостоянством внешних условий. Эти системы пригодны для культивирования клеток как в монослое, так и в суспензии.
2.8.2. Проточные культуры
Эти системы обеспечивают истинные гомеостатические условия без измеиений концентрации питательных веществ и метаболитов, а также числа клеток. Гомеостаз обусловлен постоянным вхождением среды в культуру и одновременным удалением равного объема среды с клетками. Поэтому такие системы пригодны только для суспензионных культур и монослойных культур на микроносителях. Подробнее о культурах с постоянным протоком будет сказано в разд. 4.6.
2.S.3. Выбор между непроточной и проточной культурами
Культуры с постоянным протоком представляют собой единственную систему, в которой все клетки гомогенны и могут сохранять гомогенность в течение длительного периода (месяцы). Это свойство имеет большое значение в физиологических исследованиях, однако такие культуры дороги для получения клеточных продуктов. Стоимость получения этих продуктов определяется затратой времени обслуживающего персонала, а также стоимостью среды и оборудования. При оценке стоимости следует также принимать во внимание сложность используемых оборудования и процессов, поскольку именно эти факторы определяют необходимую квалификацию персонала и влияют на надежность процесса производства продуктов. Непроточное культивирование — трудоемкий и дорогостоящий процесс, поскольку для каждого единичного сбора клеток требуется пересев и инкубация до получения конечной культуры. Определенный режим для непроточной культуры может обеспечить повтор-
ные, хотя и менее обильные сборы продукта, и чем дольше поддерживается культура в продуктивном состоянии, тем дешевле оказывается процесс получения продукта в целом. Однако для поддержания клеточной популяции на высоком уровне в течение достаточно продолжительного времени часто оказывается необходимым увеличение объемов среды, и если при этом необходимо использовать дорогостоящие ростовые факторы, то такой вариант перестает быть экономически выгодным. Поддержание высокого выхода клеток, а следовательно, высокой концентрации конечного продукта может оказаться необходимым для снижения стоимости всего процесса и перевесить, таким образом, увеличение стоимости среды. Культивирование клеток в постоянном протоке в хемостате не может обеспечить максимального выхода клеток, поскольку в этой системе действует фактор, ограничивающий рост клеток. Для получения максимального выхода клеток в этом типе культур следует использовать вариант турбидостата (см. разд. 4.6). Для некоторых практических применений, например получения цитопатических вирусов, не остается другого выбора, кроме использования непроточных культур.
3. Монослойные культуры
3.1. Введение
Флаконы и пробирки для культуры ткани, обеспечивающие поверхность роста 5—200 см2, известны любому исследователю, работающему с культурами. Самыми большими стационарными флаконами, обычно используемыми в лаборатории, являются флаконы Ру или их пластиковые одноразовые аналоги. Эти сосуды обладают поверхностью для роста клеток 175—200 см2
(в зависимости от типа сосуда), требуют для роста клеток
100—150 мл среды; объем газовой фазы составляет 750-
ЮСО см3. В этих сосудах можно получать 2ХЮ7 диплоидных клеток и до 108 гетероплоидных клеток. При необходимости получения, например, 1010 клеток придется использовать более
100 одинаковых культур, так что все манипуляции с клетками придется воспроизводить не менее 100 раз. Кроме того, для поддержания роста такого количества культур потребуется термостат С’рабочим объемом 100 л. Ясно, что настало время, когда для увеличения масштабов получения клеток следует ис-
пользовать более эффективные культуральные системы. Для получения большого количества клеток, зависимых от субстрата, следует использовать более совершенную технику культивирования; это позволит более производительно использовать обслуживающий персонал, а также существенно повысить от-
ношение поверхности роста клеток к объему культуры. Для достижения этого был разработан весьма обширный и разносторонний набор типов культуральных сосудов и систем культивирования. Многие из этих систем схематически представлены на рис. 3.6 и будут обсуждены ниже. Наиболее перспективными следует считать методы, основанные на модификации системы суспензионной культуры, поскольку они обеспечивают
