Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
2.7.4. Диффузия через мембраны
Силиконовые трубки весьма проницаемы для газов, и если культуральный сосуд снабдить длинными тонкостенными трубками, то можно добиться достаточной диффузии кислорода в культуру. Для этого, однако, требуются очень длинные трубки (например, для культуры объемом 1000 л требуются трубки длиной ,30 м и диаметром 2,5 см). Этот метод дорог и неудобен в пользовании и, кроме того, создает неразрешимую проблему при увеличении масштабов культивирования, поскольку при этом происходят трехмерный рост культуры и только двумерный рост системы газообмена.
2.7.5. Перфузия среды
Система замкнутого перфузионного контура постоянно (или по сигналу) извлекает среду из культуры и пропускает ее через устройство для оксигенации, а затем возвращает в культуру. Этот метод обладает многими преимуществами, если легко отделять среду от клеток для пропускания через перфузионный контур. Среда в устройстве для оксигенации эффективно про-булькивается для насыщения кислородом и другими компонентами, такими, например, как NaOH для контроля pH, который может повреждать клетки, если его добавлять непосредственно в культуру. Этот метод используется в системах со стеклянными бусами (разд. 3.6.1) и оказывается особенно эффективным в системах с микроносителями (разд. 3.6.3).
2.7.6. Поступление из газовой фазы
Концентрация растворенного кислорода может быть повышена путем увеличения парциального давления кислорода в газовой фазе (от атмосферных 21% до любого значения в смеси кислорода с азотом) либо путем повышения давления в культуре на 1 атм (в этом случае увеличиваются растворимость кислорода и его диффузия). Эти методы могут быть использованы лишь в хорошо изученных культурах, поскольку следует опасаться токсических эффектов кислорода. И наконец, на величину скорости поступления кислорода может влиять форма лопастей мешалки.
2.7.7. Наращивание культур клеток
Первым фактором, который обычно приходится преодолевать при увеличении массы культуры, является кислородная недостаточность. Это становится проблемой в обычных перемешиваемых культурах при объеме свыше 10 л. Однако при совре-
менном использовании культур с высокой плотностью клеток, поддерживаемых с помощью перфузии, кислородное голодание может происходить и в двухлитровых культурах. Для предсказания этапа, на котором может начаться кислородное голодание, можно использовать компьютерные модели, аналогичные предложенной Спиром и Гриффитсом [4]. Эти модели используют в качестве входных данных ростовые характеристики клеток (их тип, размер инокулята, продолжительность лаг-фазы и среднее время генерации) и характеристики системы культивирования (объем среды и газовой фазы, площадь поверхности, состав газовой смеси, давление). Программа предоставляет выбор метода аэрации (перечислены в разд. 2.7) как в перемешиваемой, так и в статической культурах. Баланс кислорода рассчитывается на 8-часовой интервал с получением величин выхода клеток и поступления и утилизации кислорода. Можно варьировать такие параметры оксигенирования, как скорость вращения мешалки и скорость тока воздуха при пробульки-вании.
2.7.8. Редокс-потенциал
Окислительно-восстановительный потенциал (ОВП), или редокс-потенциал, является показателем заряда среды, и его величина, следовательно, определяется соотношением окисляющих и восстанавливающих химических соединений, концентрации кислорода и pH. При изготовлении свежей среды и помещении ее в культуральный сосуд требуется время для установления равновесного ОВП (процесс называется уравновешиванием). Оптимальный уровень ОВП для роста многих линий клеток составляет +75 мв, что соответствует значению рОг растворенного кислорода 8—10%. Некоторые исследователи предпочитают контролировать поступление кислорода в культуру с помощью окислительно-восстановительного, а не кислородного электрода. При прослеживании изменения ОВГ1 с помощью редокс-электрода и рН-метра (с милливольтовой шкалой) можно получить данные о характере роста клеток [5]. Это связано с тем, что значение ОВП снижается в течение логарифмического роста клеток и достигает минимального значения примерно за 24 ч до наступления стационарной фазы (рис. 3.5). Такой способ оценки роста культуры является особенно эффективным, когда невозможно отбирать пробы клеток. Этот метод полезен также для предсказания момента окончания логарифмической фазы роста, чтобы смена среды, добавление вирусов или промоторов образования клеточных продуктов были произведены в оптимальное время. Влияние ОВП на клеточные культуры подробно рассмотрено Гриффитсом [6].
е
N
Часы
Рис. 3.5. Корреляция окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) с ростом клеток и поглощением глюкозы [6]. Минимальное значение ОВП достигается за 24 ч до окончания логарифмического роста клеток (А).
2.8. Типы культуральных систем
2.8.1. Непроточны* культуры
Это обычный тип культур, в котором клетки вводят в фиксированный объем среды. По мере роста клеток происходит использование питательных веществ и накопление метаболитов. Среда, следовательно, должна постоянно сменяться, что в свою очередь приводит к изменению клеточного метаболизма, часто называемому физиологической дифференцировкой. Со временем пролиферация клеток прекращается вследствие истощения питательных веществ, накопления токсичных продуктов отходов и зависящего от плотности ограничения роста в монослойных культур а-х. Известны методы увеличения продолжительности жизни непроточных культур и, следовательно, увеличения выхода клеток путем различных способов «подкормки» субстратами.
