Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
V. При приготовлении среды используйте ингредиенты высшей степени очистки, поскольку даже минимальные примеси могут оказаться токсичными в отсутствие сыворотки. Случайные примеси могут оказать и благоприятное воздействие на рост клеток, но, оставаясь неидентифицирован-
ными, приведут к снижению воспроизводимости, особенно в случаях изменений партии используемых реагентов.
VI. Для некоторых сложных сред (например, сред серии MCDB) следует создавать отдельные маточные растворы и объединять их непосредственно перед фильтрованием. Нестабильные маточные растворы (например, растворы глутамина и Fe2+) следует хранить в замороженном виде
и добавлять непосредственно перед использованием. В остальных случаях большинство стерилизованных компонентов среды в рабочей концентрации можно хранить при 4°С в течение нескольких недель.
VII. При использовании концентрированных маточных растворов следует обращать внимание на то, чтобы все компоненты оставались растворенными в течение стерилизации фильтрованием. Кроме того, при объединении нескольких концентрированных растворов, компоненты которых могут
взаимодействовать между собой, следует производить немедленное разведение до рабочей концентрации.
4.2. Стратегия оптимизации сред
Вы работаете с ^трансформированными клетками (а) или
с трансформированными (б)? Если с (а), пользуйтесь стратегией А, а если с (б), пользуйтесь стратегией Б.
4.2.1. Стратегия А
I. Для снижения стоимости исследований попытайтесь перейти от эмбриональной сыворотки к сыворотке новорожденных или взрослых телят, а далее к сыворотке лошади и человека.
II. Если возможно, постепенно снижайте концентрацию сы-• воротки примерно до 2%, чтобы адаптировать клетки.
III. Используйте субстрат, облегчающий прикрепление клеток, покрывая поверхность культуральной посуды (а) поли-D-лизином, (б) коллагеном или (в) фибронектином (см. разд. 6).
4—437
IV. Выберите среду в соответствии с данными табл. 2.2. В первую очередь следует испытать среду, рекомендованную для клеток, близких к вашим. Добавьте ростовые факторы и гормоны, которые уже дали эффект с аналогичными клетками. Если такой среды нет, испытайте в первую очередь смесь сред DME и F12 в соотношении 1:1с добавлением инсулина, трансферрина (насыщенного Fe2+) и селенита в концентрациях 5 мкг/мл, 5 кмг/мл и 30 иМ соответственно.
V. В случае плохого роста добавьте БСА в концентрации 1—5 мг/мл и/или смесь микроэлементов (коммерческий препарат) или смесь, описанную в работе [16]).
VI. Проконтролируйте метод снятия клеток с субстрата при пересеве. Обработка неочищенным трипсином может оказаться неблагоприятной для ваших клеток. В этом случае используйте чистый кристаллический трипсин, но тщательно подберите его концентрацию, продолжительность и температуру обработки (вплоть до 4°С) под контролем микроскопа. Действие трипсина останавливайте добавлением ингибитора трипсина (в возможно минимальном количестве). Вместо трипсина можно также использовать Диспазу (Тип I фирмы «Борингер»),
VII. Попытайтесь снизить концентрацию БСА при одновременном добавлении в среду гормонов или ростовых факторов (среди прочих ФРЭ, соматомедины, глюкокортикоиды, трииодтиронин) и/или дополнительные микроэлементы.
VIII. Если рост остается плохим, проверьте потребность ваших клеток в липидах. Для этого используйте микроэмульсии или липосомы, содержащие липиды сои, холестерин, лино-левую кислоту, фосфатидилэтаиоламин и другие липиды.
IX. Дополнительные советы вы найдете в ссылках [1—9].
4.2.2. Стратегия Б
I. Если клетки обнаруживают рост, зависимый от субстрата, следуйте этапам (I) и (II) стратегии А. Если рост клеток не зависит от субстрата, переходите к описанному ниже этапу (II).
II. Выберите среду, руководствуясь указаниями табл. 2.2 для типов клеток, начиная с № 29. В первую очередь попробуйте среду, использованную с клетками, похожими на ваши. Добавьте ростовые факторы и гормоны, в которых нуждаются похожие клетки.
III. Определите оптимальный размер инокулята (концентрация клеток при посеве). Начинайте с концентрации около 105 клеток/мл. Поскольку опухолевые клетки обычно продуцируют собственные ростовые факторы, слишком малый размер ииокулята может оказаться недостаточным для
обеспечения достаточной концентрации ростовых факторов.
IV. После проверки среды в соответствии с предложениями этапа (IV) стратегии А переходите к этапам (V), (VII) и (VIII) этой стратегии.
Для лейкозных клеток попробуйте использовать среды RPMI 1640 или CMRL 1066, смешивая их по необходимости со средой F12 в соотношении 1:1.
Помните, что культивируемые клетки должны отражать особенности своего происхождения, сохранять характерные свойства тканей, из которых они получены, проявлять признаки дифференцировки и пролиферации, которыми они обладали in situ. С некоторыми клетками эти цели могут быть достигнуты, но в случае других клеток следует учитывать ограничения возможностей существующих методов культуры ткани. Возможно также, что культивируемые клетки окажутся неспособными к одновременной пролиферации и экспрессии дифференциро-вочных функций. Следовательно, может потребоваться период размножения клеток, сопровождающийся периодом поддержания их в высокой плотности (более 105 клеток/см2), чтобы в клетках появились признаки дифференцировки.
