Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Конки Д. -> "Культура животных клеток" -> 27

Культура животных клеток - Конки Д.

Конки Д., Эрба Э., Френши Р., Гриффитс Б. Культура животных клеток — М.: Мир, 1989. — 333 c.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка): kulturajivotnihkletok1989.djvu
Предыдущая << 1 .. 21 22 23 24 25 26 < 27 > 28 29 30 31 32 33 .. 136 >> Следующая

Многие типы клеток либо абсолютно зависят от добавления определенных факторов роста, либо достигают оптимального роста только в присутствии этих факторов (см. гл. 2).
В суспензионных культурах часто возникают проблемы, связанные с агрегацией клеток. В связи с этим для суспензионных
культур специально разработаны среды, лишенные магния и кальция (эти ионы влияют на прикрепление клеток) (см. разд.
3.1). Для устранения агрегации клеток можно добавлять в среду низкие концентрации трипсина (2 мкг/мл).
2.6. pH
Оптимальный pH среды должен быть близок к 7,4 в начале культивирования и ие снижаться ниже 7,0 в ходе культивирования. Однако для многих линий гибридом оказывается предпочтительным pH около 7,0. При pH ниже 6,8, как правило, наблюдается подавление роста клеток. Среди факторов, влияющих на стабильность pH, следует отметить тип буфера и его емкость, объем воздушного пространства культуры и концентрацию глюкозы в среде.
Нормальной буферной системой в культуре ткани является система СОг-бикарбонат, аналогичная таковой в крови живых организмов. Это слабая буферная система со значением рКа ниже физиологического оптимума. Эта буферная система требует также добавления С02 в воздушное пространство над средой для предотвращения потери СОг и накопления гидроксильных ионов. Буферная емкость среды повышается фосфатами, присутствующими в сбалансированных буферных солевых растворах. Среды, предназначенные для уравновешивания 5%-ным С02, содержат обычно солевой раствор Эрла (25 мМ ЫаНСОз), хотя может быть использован и солевой раствор Хэнкса (4 мМ NaHC03) при уравновешивании среды воздухом. Увеличение буферной емкости и стабильности pH культуральной среды достигается благодаря использованию цвиттерионных буферов [2], таких как HEPES (в концентрации 10—20 мМ), добавляемых к бикарбонатному буферу или заменяющих этот буфер. В последнем случае концентрация бикарбоната в среде снижается до 0,5 мМ. Другие буферные системы используются в специализированных средах, например в среде Лейбовича (L-15) [3]. Эти среды используют буферную емкость свободных аминокислот, глюкоза заменена в них на галактозу и пируват, и бикарбонат не включается в состав среды. Такие среды при-годны для культивирования клеток в незакупоренных сосудах.
Объем воздушной фазы в герметически закрытых культурах важен, поскольку на начальных стадиях культивирования 5%-I ный СОг необходим для поддержания pH среды. Однако по мере роста клеток и генерации ими СОг воздушная фаза накапливает СО2 и препятствует его диффузии из водной фазы. В результате в водной фазе накапливается слабо диссоциируемый ЫаНСОз, что сопровождается избыточным образованием ионов Н+ и снижением pH среды. Следовательно, для закупоренных культур требуется большой объем воздушной фазы,
обычно в 10 раз больший, чем объем среды (такой объем необходим также для адекватного снабжения культур кислородом). Такой большой объем воздушной фазы невозможен при увеличении размера культур, и в этих случаях необходимы открытые системы с искусственным током воздуха, входящего через один фильтр и выходящего через другой.
Метаболизм глюкозы в клетках приводит к накоплению пи-рувата и лактата. Глюкоза метаболизируется значительно быстрее, чем это нужно для поддержания роста. Следовательно, концентрация глюкозы в среде не должна превышать 2 г/л,
Рис. 3.4. Схема контроля pH в культуре клеток. Н — нижняя критическая точка и В — верхняя критическая точка на шкале pH.
и лучше добавлять глюкозу в среду в ходе культивирования, чем повышать начальную ее концентрацию. В качестве альтернативы можно заменять глюкозу на галактозу и фруктозу. При этом заметно снижается образование молочной кислоты, но одновременно, как правило, снижается и скорость роста культуры. Такая замена замедляет снижение значений pH среды и достаточна для поддержания небольших культур. По мере увеличения масштабов культуры происходит снижение объема газовой фазы и поверхности культуральной среды по отношению к ее объему. Кроме того, были созданы многочисленные системы с увеличенной поверхностью для роста клеток и увеличенной клеточной плотностью по отношению к объему культуры. В результате проблема pH возникает на более ранних стадиях культивирования, поскольку ССЬ удаляется менее эффективно и увеличение количества клеток приводит к увеличению образования молочной кислоты и СОг. Выходом из создавшегося положения является более частая смена среды или создание систем контроля pH.
Основы системы контроля pH приведены на рис. 3.4. Авто-клавируемый электрод для измерения pH ( поставляется фирмой Pye Ingold, Russell) передает сигнал на рН-метр, где он преобразуется в цифровую или аналоговую форму. Для конт-
роля pH следует установить максимальное и минимальное значения pH, ограничивающие рабочий диапазон поддержания pH культуры. При достижении этих ограничивающих значений pH включаются реле, запускающие насос или соленоидный клапан, и поступающие через них компоненты возвращают значения pH в рабочий диапазон. На рис. 3.4 показаны также наиболее употребительные агенты, применяемые для доведения pH. При равновесии среды с воздушной фазой увеличение pH выше максимального критического значения является достаточно редким событием, так что добавление кислоты не требуется. При необходимости добавления щелочи рекомендуется использовать бикарбонат натрия (5,5%). Гидрат окиси натрия (0,2 М) может быть использован только при высокой скорости перемешивания культуры, когда быстрое разведение препятствует повреждению клеток высокими локальными концентрациями щелочи или же при наличии перфузионного контура. Насосы для введения жидкости поставляются обычно как компонент рН-метра. Поступление в культуру газа контролируется соленоидным клапаном. В практической работе рекомендуется подавать 5%-ный СОг в культуру через соленоидный клапан, а 95%-ный воздух — непосредственно. При превышении максимального критического pH С02 будет смешиваться с воздухом, но ниже этого значения в культуру будет поступать только воздух. Это само по себе является контролирующим фактором, поскольку облегчает удаление С02 и обеспечивает культуру кислородом.
Предыдущая << 1 .. 21 22 23 24 25 26 < 27 > 28 29 30 31 32 33 .. 136 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed