Биохимия мембран. Кинетика мембранных транспортных ферментов. Том 5 - Кометиани З.П.
ISBN 5-06001355-3
Скачать (прямая ссылка):
Эта необходимость вытекает из того факта, что при малых концентрациях
комплекса Д^АТФ, когда появляется возможность пренебречь членами
уравнения скорости с квадратичными и более высокими степенями, все
экспериментальные кривые с высокой точностью описываются моделью
Плеснера.
На основе представленного выше экспериментального материала и
литературных данных аналогичного характера можно сформулировать
необходимые условия, выполнение которых будет носить обязательный
характер для истинной <гминимальной" модели Na, К-АТФазной системы.
Условие 1. При фиксировании концентрации ионов Mg2+ экспериментальные
кривые в обратных координатах представляют собой семейство функций
UM=f{l/S) со следующими характерными признаками: кривые монотонно
возрастают; кривые не имеют перегиба, причем нулевое значение функции
достигается при очень больших значениях кривые выпуклы при малых значе-
ниях аргументов; кривые имеют асимптоты; кривые являются дробно-
рациональными функциями следующего вида:
Условие 2. Значения коэффициентов асимптоты функции Um~ =/(<) зависят от
величины фиксированного М. Должны выполняться следующие условия:
зависимость наклона асимптоты от М монотонно возрастающая функция,
выпуклая при малых значениях М и переходящая в прямую; отсекаемый
асимптотой отрезок ординаты также зависит от М, это вогнутая кривая,
имеющая минимум и стремящаяся к асимптоте.
Условие 3. При фиксированной концентрации свободного АТФ
экспериментальные кривые в обратных координатах представляют
72
семейство функций UA=f(t), которые: содержат одну точку экстремума; при
больших значениях А не имеют, а при малых значениях А имеют перегиб,
причем перегиб имеет место при 1 мМ имеют асимптоты; являются дробно-
рациональными функциями следующего вида:
p+m+l I р+1
UA=t 2 Ь'-' / 2 где р> 1 и т> !•
/-о / /-о
Условие 4. Значение коэффициентов асимптоты функции ?/Л = =f(t) зависит
от величины фиксированного А. Должны выполняться следующие условия:
наклон асимптоты является линейной функцией А; отсекаемый асимптотой
отрезок ординаты имеет вид гиперболической функции; при малых значениях А
первая производная отрицательна, при больших - равна нулю.
Условие 5. Из экспериментов с фиксированием концентрации MgATO вытекают
следующие условия: кривые имеют точку экстремума; в зависимости от
значения 5 кривая может иметь точку перегиба; кривая имеет асимптоту.
Условие 6. Нши = С, где С конечная, не равная нулю величина.
S-*eo
Это условие вытекает из экстраполяции кривых при экстремально большой
концентрации лигандов. Его выполнение не вызывает сомнения при малых
значениях свободного АТФ. Однако при очень больших значениях свободного
АТФ из-за резкого увеличения спонтанного расщепления АТФ и одновременного
уменьшения активности резко увеличивается относительная ошибка измерения,
что снижает достоверность определения предела lim v при А-*-оо. Поэтому в
дальнейшем не будет исключаться возможность, что limo=0, при S-*~oo и А-
>оо.
В самом общем случае рассмотренные условия диктуют следующую минимальную
схему:
73
Эту симметричную относительно ОЕО модель можно упростить:
1/2 ОЕО
SK?
SEP
К-2 ак2 к//s'
АЕО
~7
АЕР
Схема 3
5.2. Анализ дробно-иррациональных функций
Для уточнения схемы 3 желательно исследовать кинетические кривые с
фиксированным отношением М/А. При фиксировании концентрации одного из
лигандов системы S, А и М скорость формально становится функцией одного
переменного. В этом случае учитывается воздействие на скорость всех трех
лигандов. Правда, при достаточно больших концентрациях одного из
свободных лигандов (А или М), независимо от значения 5, можно пренебречь
действием второго свободного лиганда, но тогда диапазон изменения
концентрации фиксированного лиганда будет резко ограничен. Этих
затруднений можно избежать, если использовать способ фиксации отношения
К-М/А. Тогда М=]/Г^Кт$ и А=Угде Кт - константа диссоциации комплекса
MgATO.
Следовательно, при достаточно больших значениях К, из-за малой величины А
можно пренебречь его действием на скорость, а при достаточно малых
значениях К - действием М. Вышеизложенное хорошо иллюстрирует диаграмма
на рис. 20. Следует отметить, что варьирование М в диапазоне Л1<0,1 мМ и
А в диапазоне А< <0,02 мМ не вызывало достоверного изменения скорости
реакции. Кроме того, оказалось, что при М>5 мМ действием А также можно
пренебречь. Поэтому удовлетворительными можно считать отношения К = 100 и
1 = 0,01.
При фиксированном отношении "к = М/А скорость реакции превращается в
дробно-иррациональную функцию. При аначизе формы таких кривых
обнаруживаются некоторые сложности, однако возможность исключения
действия одного из лигандов при широком диапазоне изменений двух
остальных сильно облегчает расшифровку молекулярного механизма фермента.
Испо [ьзуя метод Кинга - Альтмана, можно легко получить уравнение
стационарной скорости, которое, учитывая, что А =
, имеет вид:
Po + Pl/2* ^2 + Pi* 1 + Рз/2* 3^2 + № 2
