Биохимия мембран. Кинетика мембранных транспортных ферментов. Том 5 - Кометиани З.П.
ISBN 5-06001355-3
Скачать (прямая ссылка):
2е0 (arf-i + a3/2t 3/2 + a2t~2)
74
Модель, введенная в предыдущем разделе (схема 3), накладывает
определенные ограничения. Например, а0 и ai/2 - коэффициенты числителя
дробно-иррациональной функции U0,oi=f(t), равны нулю. Тогда при больших
значениях аргумента форму кривой
Рис. 20. Диаграмма зависимости /4M=/CT"S:
Кт=0,09 мМ; цифрами около кривых обозначена концентрация комплекса 5
(мМ); пунктирные линии соответствуют фиксированному отношению К-М/А
будет определять поведение следующих функций: dU0,o\/dt и
d'2U0,o\/dt2. Можно показать, что:
lim
dW,
0,01
Ро
<*о
>0; lim d2tfW"..= -0;
/->oo
alPl/2 - аЗ/2?0
2a?
)
CO
После подстановки значения коэффициентов получим:
(аз/ft*-<^1/2)=
-/?
k°
ps
~к7
н
Ка
<0,
где Ks и Ка - определенные комбинации констант равновесия (Ki) отдельных
ступеней реакции, изображенной на схеме 3. Учитывая, что аг- и Рг
положительные величины, получим, что при больших значениях аргумента
форма расчетной зависимости (по схеме 3) в точности совпадает с формой
экспериментальной кривой (монотонно возрастающая, выпуклая кривая,
касательная всегда
75
пересекает положительную часть ординаты, не имеет асимптоты), которая
показана на рис. 21.
Таким образом, исследование формы кинетических кривых позволяет
определить, что ao=ai/2 = 0, а\фО, и (Зз/2=^0 (или (Згэ^О). Так как
приходится допустить связывание с фосфорилированным ферментом свободного
АТФ (рз/г^О) или комплекса MgATO (р2Ф
Рис. 21. Зависимость Na, К-АТФазной активности (мкмоль Фн/ч на 1 мг
белка) от концентрации А (чМ) в обратных величинах при различных
фиксированных значениях \=М1А
=т^0), было бы логично предположить связывание их обоих, тем более что
аналогичная ситуация имеет место в случае нефосфорили-рованного фермента.
Форма экспериментальных кривых ?/0,oi=/(0 при малых значениях аргумента
(рис. 21) выдвигает определенные ограничения для зависимости,
рассчитанной по схеме 3.
Ит(r)(r)<0, Пт >0.
/->о d / /-> о 'wo
dt2
Легко убедиться, что эти ограничения исключают возможность одновременного
соблюдения условий: аз/2 = 0 и аг^О; тогда остается три варианта: 1) аз/2
= аг = 0; 2) аз/г?=0, а2=0 и 3) аз/2^0, а2=7^0. Во всех трех вариантах
должно выполняться условие:
р2
kPAkKs
( К-* + + к. ^)<0-
(а2рз/2--аз/2р2) =
5 А "ps
Выполнение этих условий возможно, если допустить, что &°ps=0 (а0=0) или
k°ps - сравнительно малая величина (1/&°р*>^
76
[(1//С_2+(1/^4) + (1/^ра)]. Таким образом, можно заключить, что схема 3
хорошо описывает экспериментальную кривую и, следовательно, на ее основе
может быть построена минимальная модель.
При фиксированном отношении Х=100 экспериментальная кривая (рис. 21)
содержит две четко выраженные точки перегиба. При малых и больших
значениях аргумента кривая выпуклой формы, тогда как при средних
значениях она вогнута. Зависимость не имеет точки экстремума, при /->-0
стремится к конечному, не равному нулю пределу. Учитывая, что Л = 0 и
беря за основу схему 3, необходимо попытаться согласовать с экспериментом
следующую модель:
к'.
М
0Е0
к.~
SKi
CEQ+ 0ES
К-i
MES
Схема 4
В этой модели учтены наиболее важные экспериментальные факты, полученные
ранее. Например, согласно схеме 4 фермент не может фосфорилироваться,
если он предварительно присоединил ион магния, соответственно отсутствует
путь МЕ-+ЕР; фосфорили-рованный фермент может быть связан с двумя ионами
магния (R. Post et al., 1972; С. Pedemonte, L. Beauge, 1983).
Используя метод Кинга - Альтмана, можно получить уравнение
стационарной скорости для схемы 4, учитывая, что М = У^\Кт*~1:
..____________Ро + Pl/2*"1^ + • • • + 1*5/2*~5/2_
100 2е0 (ai*-1 + a3/2t3/2 + a2t~2... + a5/2f-s/2)
Эта дробно-иррациональная функция Uwo=f(t) при больших значениях
аргумента должна иметь такую же форму, как и функция ?/o.oi=/(0.
Действительно, a0=ai/2 = 0 и (аз/2-aiPi/2)<0. Проведя анализ функции ?/юо
и ее производных, можно получить, что если kpo^O и k'ps^kPps, то
зависимость, рассчитанная по схеме 4, может иметь форму монотонно
возрастающей, выпуклой функции. Для почного доказательства идентичности
форм расчетной и экспериментальной кривых необходимо исследовать знаки
коэффициентов уравнения (?/юо)""=0. В результате такого исследования
77
был сделан вывод, что наличие точки перегиба не является обязательным.
Таким образом, модели, изображенные на схемах 3 и 4, могут объяснить
форму экспериментальных кривых, полученных при фиксированном отношении
М/А (А,= 100 и л = 0,01).
Принципиальное отличие экспериментальных кривых, получаемых автором и
сотрудниками, от экспериментальных кривых, встречающихся в литературе,
заключается в том, что в обратных координатах при малых значениях
аргумента первые имеют нелинейный характер. Как правило, в литературе
редко рассматривают область больших концентраций субстрата [MgATO]>l мМ;
видимо, подразумевая, что при этих концентрациях существует линейная
зависимость. Проверка формы кривых при фиксированном отношении к= 1
