Биохимия мембран. Кинетика мембранных транспортных ферментов. Том 5 - Кометиани З.П.
ISBN 5-06001355-3
Скачать (прямая ссылка):
а также возможности взаимопревращения этих участков. Видимо, с точки
зрения получения новой информации, исследования ионных потоков в "тенях"
эритроцитов и реконструированных везикулах, а также исследования прямого
связывания катионов себя исчерпали, тогда как анализ зависимости скорости
ферментативной реакции от концентрации ионов Na+ и К+ может дать
дополнительную информацию для окончательного решения вопроса.
Кинетические кривые, представляющие эти зависимости, обычно имеют сложную
геометрическую форму. Для их эффективного исследования необходимо
использовать новые методы анализа формы кривых (см. гл. 3 и 4). Методы
классической кинетики, направленные в основном на определение
кинетических параметров, которые отражают константы скорости (Vmax, Km,
Kt и т. д.), дают только косвенную информацию о количестве участков
связывания лигандов. В отличие от первых, методы анализа формы кривых
направлены на определение степенных параметров уравнения скорости, что
дает возможность непосредственной оценки количества участков связывания и
вида модификатора. Это обстоятельство наиболее важно для расшифрования
молекулярного механизма регуляции Na, К-АТФазной активности ионами Na+ и
К+.
6.2. Определение числа Na-центров Na,
К-АТ Фазы
Рассмотрим Na, К-АТФазную активность как функцию одного переменного -
концентрации Na+(x). Тогда при постоянстве всех прочих параметров и
переменных реакции в самом общем случае зависимость v-f(x) будет иметь
вид дробно-рациональной функции:
хп У1, щх1
S *
2 м1
/=о
где v - стационарная скорость или скорость, рассчитанная в условиях
быстрого равновесия, s-n-\-p-\-m. В обратных координатах это выражение
примет вид:
86
f 2 w-'
тг^ .
2
/-0
где U = \/v и t=\/x.
Заметим, что независимо от способа определения скорости в условиях
стационарного или быстрого равновесия степенной параметр п этих выражений
всегда можно интерпретировать как количество лигандсвязывающих участков,
предназначенных для необходимого активатора (см. гл. 1). Однозначная
интерпретация остальных параметров уравнения скорости затруднена, так как
их
Рис. 22. Зависимость Na, К-АТФазной активности (у, мкмоль Фн/ч на 1 мг
белка) от концентрации натрия (А) и та же зависимость в координатах In v
от lANa+] (Б):
реакционная среда: 40 мМ трис-HCl, [АТФ]=3 мМ,
[MgCl.]=3 мМ. [КС1]=130 мМ, pH 7,8
физический смысл зависит от молекулярного механизма фермента. Однако их
определение может сыграть существенную роль в расшифровке последнего.
В дальнейшем будут использованы следующие обозначения: пх - количество
Na-участков, для которых Na+ - необходимый активатор; пу - количество К+-
участков, для которых К+-необходимый активатор; sx, рх и тх - степенные
параметры для функ-
87
ции v=f(\), f/=const; sy, py, my - степенные параметры зависимости
v=f(y), *=const.
Требуется определить nx и mx. Для этого можно использовать описанный выше
метод, сущность которого заключается в исследовании формы кинетических
кривых в области экстремальных концентраций лиганда при помощи степенного
преобразования. Как было показано, при степенном преобразовании (v)~Wr-
f{\/х) в области достаточно малых концентраций лиганда новая зависи-
¦мость будет иметь асимптоту и максимально приближаться к линейной
функции только при значении г-пх. Аналогично при степенном преобразовании
(v)~l/r=f(x) в области достаточно больших концентраций лиганда новая
зависимость будет иметь асимптоту и максимально приближаться к линейной
функции только при значении г-тх. Приведенный ниже пример иллюстрирует
описываемый метод.
Определим пх для зависимости v=f(x) при фиксированных значениях [ КС1] =
130 мМ; [MgATO]=2,5; [АТФСВ]=0,5 и [Mgcu2+]=0,5 мМ (рис. 22). Анализ
удобно проводить с помощью ЭВМ. Введем исходные данные в виде Xi, v-lt
ог- и Ki, где х,- - концентрация натрия, мМ; Ki- количество параллельных
измерений для определения активности; vL - средняя арифметическая Ki
определений активности для данного л(мкмоль Фн/ч на 1 мг белка); at -
средняя квадратичная ошибка среднего арифметического. Как правило, в
описываемых экспериментах /Ci=const. Результаты вычислении при помощи ЭВМ
показаны в табл. 10.
Таблица 10. Пример обработки па ЭВМ данных по активации Na, К-АТФазы
ионами натрия Х= 6.000 Vi = 4.270 Ot=1.130 S=0.777
11.000 13.060 0,470 ?=0.056
16.000 21.040 0.500
21.000 28.690 0.240
31.000 40.640 1.700
51.000 53.130 1.060
96.000 65.760 0.870
/=0.166667 In ?/=-1.451614 STEP =1.0
0.090909 -2.569554 max (r) =8.0
0.062500 -3.046425 GRAF-MU=7A15864
0.047619 -3.356549 6.126006
0.032258 -3.704753 4.774965
0.019608 -3.972742 2.871983
0.010417 -4.186012 1.520443
S7"?P= 1.0 r = 1.0 7.005121 22.503998 120.746481 г=2.0
шах (г) =80 At/= (A+BX)-Y At/= {A+BX)-Y
GRAF-Af К=7.119844 -0.022798 -0.014167
6.133933 0.029112 0.017654
4.790183 0.018511 0.010581
2.890645 0.010419 0.007442
1.524962 -0.000766 0.001709
7.243639 -0.012634 -0.007908
25.942676 -0021844 -0.015312
