Биохимия мембран. Кинетика мембранных транспортных ферментов. Том 5 - Кометиани З.П.
ISBN 5-06001355-3
Скачать (прямая ссылка):
270.755771
88
/=3.0 Д U=(A+BX)-Y -0.005299 -0.007201 -0.002388 0.002752 0.002202 -
0.002875 -0.006369
г=6.0 AU=(A + BX)-Y О 003277 -0.002676 -0.005170 -0.002233 0.001718
0.001996 0.003092
r= 4.0 V= 4 283187 12.890858 21.390849 28.681348 39.782429 53.224361
66.995872
г- 3.0 /(/(= 0 999271 Aft/= 7.005121 MV= 7.243639 1= 0.000552
r=4.0 AU= (A+BX)-Y -0.000536 0.001717 -0.001926 0.000031 0.002117 -
0.000164 -0.001238
r=4.0 Y (EXP) =0.695654 0.526034 0.466916 0.432083 0.396061 0.370395
0.351164
r= 1.0 KK= 0.965499 nu= 120.746481 MV= 270.755771 L= 0.007193
r = 4.0 KK= 0.999923 ЛШ= 1.520443 /WV= 1.524962 L= 0.000063
r=5.0 AU= (A+BX)-Y -0.001956 -0.001144 -0.004096 -0.001443 0.001919
0.001250 0.001557
r= 4.0 A= 0.326912 S(A)= 0.000968 B= 2.209231 S(B)= 0.012242 5(УХ)=
0.001612
г- 2.0 KK= 0.994771 ЛШ= 22 503998 MV= 25.942676 L= 0.002669
r=* 5.0
KK= 0:999776 MU= 2 871983 MV= 2.890645 L= 0.000222
Обработка данных на ЭВМ разделена на несколько этапов. На первом этапе
вычисляют значения In Ui и ti, строят зависимость In U-f(t) и на рабочем
интервале определяют знак второй производной (In U)"tt (и соответственно
знак функции /?(/)" см. гл. 4). В рассматриваемом случае получают
выпуклую кривую (рис. 22, Б; рис. 23, Л); следовательно, нет
необходимости ограничивать рабочий интервал сверху. Нижняя граница
рабочего интервала также подобрана корректно. Об этом можно судить по
сигмоидальной форме кривой v-f(x), которая имеет в рабочем интервале
только один перегиб и не имеет точки экстремума. На втором этапе для
каждого заданного значения степенного параметра производят степенное
преобразование Uri= (t>i)~1/r и рассчитывают соответствующую линии
регрессии
Ur=Ar+Brt.
На третьем этапе для каждого заданного г необходимо произвести следующие
действия.
1. Вычислить отклонения экспериментальных точек щ от линейной регрессии
(AUri-Uri-Uri) и определить их знак (рис. 23, Б\ табл. 10).
2. Вычислить Ат и Вг, их ошибку 5(Л) и 5(Б), а также ошибку регрессии
5(ух).
89
3. Вычислить коэффициент корреляции (/С/С) и величину L (табл. 10) и
оценить линейность зависимости.
4. Вычислить взвешенную квадратичную ошибку для U:MU (табл. 10 и рис. 23,
В).
5. Вычислить взвешенную квадратичную ошибку для V:MV. Из этих результатов
видно, что для данной зависимости v =
=f{x) имеем пх-4. Действительно, при г = 4 происходит перестройка
распределения знаков Дщ (вогнутая кривая превращается
Рис. 23. Пример расчета параметра пя. А - зависимость In l/о и Б-'/I/о от
обратной величины концентрации Na+; В - зависимость взвешенной
квадратичной ошибки (MU) от значений параметра г
в выпуклую кривую); L<F (F - критерий для 1%-ного уровня значимости 9,55;
vi = 21, V2=5); MU, MV и L - минимальны. Заметим, что для определения
параметра т в ЭВМ вместо величины xt-вводят его обратную величину 1/х. В
этом случае программу ЭВМ, рассчитанную для определения п, можно без
изменений использовать для определения т.
Для успешного определения параметра п необходимо подобрать условия
эксперимента, позволяющие добиться по возможности медленного нарастания
функции. В этом случае возможности метода исследования формы кривой резко
возрастают. Поэтому целесообразно проводить исследования при больших
концентрациях конкурентного лиганда, уменьшая этим вероятность
образования участков, связанных с лигандом, что, со своей стороны, должно
вызвать
90
уменьшение градиента зависимости v=f(x). Наоборот, для полного выявления
тормозных участков (образующих "тупиковые" ответвления и т. д.) следует
максимально уменьшить концентрацию конкурентного лиганда. Учитывая эти
условия, параметры пх и тх для зависимости v=f(x) определяли
соответственно при [КС11 = = 130 и [КС1] = 1 мМ.
Таким образом, при эквимолярном соотношении ATO/MgCl2 и больших
концентрациях ионов К+ Na, К-АТФазная система содержит четыре Na-участка,
предназначенных для необходимого активатора. Этот результат оказался
неожиданным, так как на основе многочисленных литературных данных
следовало ожидать, что число необходимых активаторов не будет превышать
числа транспортных участков для Na+. Эксперимент был многократно повторен
на различных препаратах фермента (нативные микросомы; микросомы,
обработанные дезоксихолатом, йодистым натрием и т. д.), но результат
оставался неизменным. Также неэффективным было уменьшение концентрации
КС1 до 12-24 мМ. Оказалось, однако, что количество Na-участков,
предназначенных для необходимых активаторов, зависит от соотношения
ATO/MgCb. При избытке свободного АТФ или при малых значениях концентрации
Д^АТФ пх оказалось равным трем, тогда как во всех остальных случаях пх =
4 (рис. 24).
На рис. 25 представлены результаты определения параметра зависимости
v=f(x) при различном соотношении свободных лигандов М и А, но при
сравнительно больших концентрациях субстрата [MgATC>]>l мМ. Эти условия
были подобраны на основе результатов, полученных в предыдущей серии
опытов. Легко убедиться, что во всех случаях тх^3.
