Стрессовый белок БХШ 310: характеристика и функции в растительной клетке - Колесниченко А.В.
ISBN 5-98000-005-4
Скачать (прямая ссылка):
субъединиц очищенного БХШ 310 (2) с антителами против
митохондриального разобщающего белка PUMP; (Б) Вестерн-блоттинг
субъединиц очищенного БХШ 310 с антителами против К-сегмента дегидринов
(1) и антисывороткой против БХШ 310 (2). М - белки-метчики.
Поскольку БХШ 310 не оказался иммунохимически родственным известным
митохондриальным разобщающим растительным белкам, C. Downs (Чарльстон,
США) предпринял попытку определения N'-концевой последовательности
аминокислот субъединицы БХШ 310 с молекулярной массой 56 кДа. В
результате ее была получена следующая N'-концевая последовательность
аминокислот - MNTGGAHSDE в однобуквенном коде. Полученный в результате
частичного
75
сиквенса белка фрагмент полностью совпадал с N'-концом дегидрина с мол.
массой 35 кДа, выделенного из Vigna unguiculata L. Walp A. Ismail, A.
Hall и T. Close (Ismail et al.,
1999). В связи с этим была предпринята попытка определить, не является ли
субъединица БХШ 310 с молекулярной массой 56 кДа дегидрином или
дегидриноподобным белком.
Анализ белка БХШ 310 при помощи антисыворотки против К-сегмента
дегидринов, любезно предоставленной доктором T. Close (Лос-Анжелес, США),
показал, что ни одна из субъединиц БХШ 310 не реагировала с антителами
против К-сегмента дегидринов (рис. 35Б). В связи с этим можно сделать
вывод, что у субъединиц БХШ 310 отсутствует данный сегмент, и субъединица
56 кДа, хотя и имеет N'-конец, совпадающий с N'-концом дегидрина из Vigna
unguiculata L. Walp, не принадлежит к дегидринам.
10 МЕХАНИЗМ РЕГУЛЯЦИИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ
АКТИВНОСТИ БХШ 310
Известно, что некоторые стрессовые белки оказывают протекторное действие,
ассоциируя с митохондриями во время теплового стресса (Войников и др.,
1988; Chou et al., 1989). Быстрое разобщающее действие БХШ 310, а также
известные случаи ассоциации белков с митохондриями и приведенные выше
данные о наличии БХШ 310 в цитоплазме и митохондриях холодостойких злаков
позволили предположить, что во время холодового шока происходит
ассоциация БХШ 310 с митохондриями. В то же время данные о различии
характеристик цитоплазматического БХШ 310 в нестрессированных и
стрессированных проростках позволили предполагать различное влияние этих
двух форм стрессового белка БХШ 310 на энергетические функции
митохондрий. Для выяснения этого вопроса были поставлены эксперименты по
изучению ассоциации экзогенного БХШ 310 с митохондриями во время
моделирования низкотемпературного стресса и по изучению влияния БХШ 310,
выделенного из стрессированных
76
и нестрессированных растений на энергетические функции изолированных
митохондрий.
10.1 Ассоциация БХШ 310 с митохондриями озимой пшеницы при
инкубации in vitro
Поскольку ранее было показано, что инкубация интактных изолированных
митохондрий озимой пшеницы в течение 30 мин при 00С с белком холодового
шока БХШ 310 в концентрации 0.5 мг БХШ 310 на 1 мг митохондриального
белка вызывает значительное увеличение скорости дыхания митохондрий в
состоянии 4 (Voinikov et al., 1998), то при изучении ассоциации БХШ
310 с изолированными
митохондриями пшеницы было применено такое же соотношение БХШ 310 и
митохондриального белка и такая же временная экспозиция. Электрофорез с
ДДС-Na с последующим вестерн-блоттингом с поликлональными антителами
против БХШ 310 показал, что свежевыделенные из нестрессированных
("контрольных") проростков озимой пшеницы очищенные митохондрии
содержали только
незначительное количество субъединиц БХШ 310 (рис. 36). Электрофорез
нативных митохондриальных белков с последующим вестерн-блоттингом
показал, что, как и было показано ранее (Kolesnichenko et al., 1999), в
митохондриях присутствовал собственно БХШ 310, более низкомолекулярные
комбинации его субъединиц и субъединицы этого стрессового белка (рис.
37).
Инкубация этих митохондрий при 00С в течение 30 мин вызывала лишь
незначительное снижение содержания
субъединиц БХШ 310, выявляемых электрофорезом с ДДС-Na
(рис. 36), но электрофорез нативных белков показал, что при этом БХШ 310
диссоциирует до своих субъединиц (рис. 37). В то же время инкубация этих
митохондрий при 00С в течение 30 мин со стрессовым белком БХШ 310 вызвала
сильную ассоциацию этого стрессового белка с митохондриями (рис. 36; рис.
37). Для выяснения вопроса, прочно ли связывается этот белок с
митохондриями, или он легко диссоциирует после
77
окончания холодового воздействия, была проведена инкубация в течение 3
часов митохондрий с ассоциированным с ними БХШ 310 как в присутствии, так
и в отсутствии проназы Е в среде инкубации митохондрий. Эксперимент с
обработкой митохондрий проназой Е (0.3 мг/мл, 3 ч при 37°С) по казал, что
эта обработка устраняет субъединицы БХШ 310 из спе ктра митохондриальных
белков (рис. 36) (Kolesnichenko et al., 2000с). Более того, даже простая
инкубация этих митохондрий в среде инкубации в течение 3 часов вызвала
уменьшение содержания субъединиц БХШ 310 до уровня, характерного для
