Стрессовый белок БХШ 310: характеристика и функции в растительной клетке - Колесниченко А.В.
ISBN 5-98000-005-4
Скачать (прямая ссылка):
контрольных проростков (рис. 36). Таким образом, на основании этих данных
можно предположить, что этот стрессовый бело к либо не транспортируется
внутрь митохондрий, а локализуется снаружи митохондрий.
1 2345 6 7 8 12345678
А В
Рис. 36. ДДС-Na-электрофорез митохондриальных белков озимой пшеницы (А) с
последующим вестерн-блоттингом с поликлональными антителами против БХШ
310 (В). Митохондрии: контрольные (1); инкубировавшиеся 30 мин при 00С
(2); инкубировавшиеся 30 мин при 00С с БХШ 310 (3); инкубировавшиеся 3 ч
в среде инкубации после инкубации с БХШ 310 (4); инкубировавшиеся 3 ч с
проназой Е после инкубации с БХШ 310 (5); инактивированные CCCP и
инкубировавшиеся 30 мин при 00С с БХШ 310 (6); инактивированные KCN и
инкубировавшиеся 30 мин при 00С с БХШ 310 (7); БХШ 310 (8).
78
12345 12345
•Ml
' . : i
A В
Рис. 37. Электрофорез нативных митохондриальных белков озимой пшеницы (А)
с последующим вестерн-блоттингом с поликлональными антителами против БХШ
310 (В). Контрольные митохондрии (1); митохондрии, инкубировавшиеся без
добавок (2); инкубировавшиеся с БХШ 310 (3); инактивированные CCCP,
инкубировавшиеся с БХШ 310 (4); инактивированные KCN, инкубировавшиеся с
БХШ 310 (5).
Известно, что градиент эле ктрического потенциала Д^ и зависимое от АТФ
функционирование митохондриального компле кса БТШ 70 являются двумя
основными энергетическими источниками импорта белков из цитоплазмы в
митохондрии (Pfanner et al., 1997). Импорт в митохондрии таких известных
разобщающих белков, как UCP и АДФ/АТФ переносчик также зависит от Д^
(Pfanner et al., 1997). Таким образом, можно ожидать, что инактивация
митохондрий таким чрезвычайно эффективным разобщителем, как CCCP или KCN,
который полностью ингибирует дыхание, будет полностью инактивировать
механизм транспорта белков в митохондрии и ингибировать ассоциацию БХШ
310 с митохондриями в том случае, если он транспортируется в митохондрии.
Электрофорез с ДДС-Na с последующим вестерн-блоттингом показал, что
инактивация митохондрий озимой пшеницы СССР (1.5 цМ) и KCN (1.5 мМ) не
ингибирует
79
ассоциацию БХШ 310 с митохондриями (рис. 36). С другой стороны, эле
ктрофорез нативных белков с последующим вестерн-блоттингом по казал, что
между ассоциацией БХШ 310 с интактными и инактивированными митохондриями
существует определенная разница. Если с инта ктными митохондриями
ассоциируют и нативная форма БХШ 310, и довольно высо комолекулярные
композиции его субъединиц (рис. 37), то с ина ктивированными
митохондриями
ассоциировали только субъединицы БХШ 310 (рис. 37). В то же время и между
ассоциацией БХШ 310 с инактивированными СССР и KCN митохондриями была
отмечена определенная разница. Если с ина ктивированными СССР
митохондриями ассоциировали только субъединицы БХШ 310 с молекулярными
массами 66 и 56 кДа (рис. 37), то с митохондриями, ина ктивированными
обработкой KCN,
ассоциировали также гомо- и гетеродимеры его субъединиц (рис. 37).
Та ким образом, полученные данные позволяют предполагать, что механизм
ассоциации БХШ 310 с митохондриями не зависит от Д^. По-видимому,
цитоплазматичес кий БХШ 310 ассоциирует с митохондриями с наружной
стороны, возможно вступая при этом во взаимодействие и образуя комплекс с
иммунохимически родственными ему полипептидами наружной мембраны
митохондрий. Эти данные позволяют та кже предположить, что механизм
разобщающего действия БХШ 310 должен отличаться от механизма действия
остальных известных разобщающих белков.
10.2 Сравнение влияния конститутивно синтезируемой и стрессовой
формы БХШ 310 намитохондрии in vitro
Ка к показали результаты исследований, во время низкотемпературного
стресса от макромолекулы стрессового белка БХШ 310 отщепляется лиганд -
связанная с ним
нуклеиновая кислота. Вследствие этого можно предположить, что данное
конформационное изменение способно вызвать
80
изменение разобщающей а ктивности БХШ 310. С целью выяснения этого было
проведено изучение разобщающей а ктивности белка БХШ 310, выделенного из
"контрольных" проростков и проростков, подвергнутых холодовому шоку (-
1°С, 1 час). Изучение разобщающей а ктивности БХШ 310 проводилось на
изолированных митохондриях побегов проростков озимой пшеницы сорта
"Заларинка" (Pobezhimova et al., 2001).
Таблица 9
Влияние конститутивно синтезируемой и стрессовой формы БХШ 310 на
дыхательную активность митохондрий озимой пшеницы1 во время инкубации в
течение 90 мин при 00C. Субстрат окисления: малат (10 мМ) +
глутамат (10 мМ). M±m, n=6
Инкубация, мин Поглощение кислорода, нмоль 02/мин/мг белка
Дыхательный контроль Отношение АДФ:0
Состояние 3 Состояние 4
Без добавления белка (контроль)
5 61.7+3.6 22.3+1.4 2.78+0.16 2.82+0.07
30 60.9+3.1 22.2+1.9 2.73+0.20 2.74+0.09
60 58.2+4.9 22.2+1.3 2.63+0.25 2.68+0.16
90 57.8+3.4 21.6+1.0 2.65+0.26 2.60+0.15
С добавлением конститутивно синтезируемой формы БХШ 310
5 61.7+4.9 25.0+0.2 2.48+0.23 2.72+0.01
