Стрессовый белок БХШ 310: характеристика и функции в растительной клетке - Колесниченко А.В.
ISBN 5-98000-005-4
Скачать (прямая ссылка):
в митохондриях in vitro (Побежимова и др., 1996; Voinikov et al., 1998).
С другой стороны, все известные к настоящему моменту UCP-подобные
разобщающие белки принадлежат к семейству митохондриальных переносчиков
анионов и являются белками внутренней мембраны митохондрий (Jezek et al.,
1998). Это позволяет предположить, что в митохондриях злаков могут
присутствовать субъединицы БХШ 310 или родственные им полипептиды. В
связи с этим, следующим этапом исследований был поиск иммунохимически
родственных БХШ 310 полипептидов в субмитохондриальных фракциях озимой
пшеницы. Для определения локализации были использованы очищенные по
модифицированной методике (Побежимова и др., 2001) в градиенте перколла
митохондрии 3-х суточных побегов озимой пшеницы и полученные из них
субмитохондриальные фракции.
8.4.1 Получение и определение чистоты мембранных фракций и матрикса
митохондрий озимой пшеницы
Фракции митохондриальных мембран и матрикса были получены из очищенных с
помощью перколла и неоднократно промытых митохондрий, изолированных из
этиолированных побегов озимой пшеницы. Отделение внешней мембраны
осуществляли по методу "сжатие-набухание-сжатие" (Guillot-Salomon et al.,
1997). Для этого митохондрии помещали в гипертоническую среду. Затем
суспензию "сжатых"
69
митохондрий быстро вводили в слабо гипотоническую среду, содержащую
калий-фосфатный буфер и ЭДТА. Обработка митохондрий фосфатом и ЭДТА
приводила к набуханию органелл и разрыву наружной мембраны. Последующее
добавление к суспензии набухших митохондрий гипертонической среды
вызывало сжатие митопластов (матрикса, ограниченного внутренней
мембраной) и позволяло отделить наружную мембрану. Фракции внутренней
мембраны и матрикса митохондрий были получены из митопластов,
обработанных ультразвуком, при помощи центрифугирования и
ультрацентрифугирования (Азарашвили и др., 1997). Чистота полученных
субмитохондриальных фракций определялась по активности маркерных
ферментов (Moore, Proudlove, 1983) (табл. 8).
Таблица 8
Активность маркерны1х ферментов в субмитохондриальных фракциях
озимой пшеницы!. M+m, n=6.
Ферменты- маркеры Активность ферментов во фракциях митохондрий,
нмоль в мин на мг белка
Внешняя мембрана Внутренняя мембрана Матрикс
Ант.-чувствительная НАДН: цитохром с оксидоредуктаза не определяли
76+8.33 0
Ант.-нечувствительная НАДН: цитохром с оксидоредуктаза 63+5.1 0
не определяли
Малатдегидрогеназа не определяли 740+60 3614+113
Фумараза не определяли 0 910+67
Примечание. Сокращения: Ант.- антимицин А.
Сравнение между активностями антимицин-чувствительной НАДН: цитохром с
оксидоредуктазы (маркера для внутренней мембраны) и антимицин-
нечувствительной НАДН: цитохром с оксидоредуктазы (маркер для внешней
70
мембраны) позволило заключить, что полученные фракции внешней и
внутренней мембран митохондрий не имели взаимных загрязнений. В то же
время во фракции внутренней мембраны отсутствовала активность фумаразы
(маркер для матрикса), что свидетельствует о том, что она не была
загрязнена матриксом (табл. 8). Что касается матрикса, то эта фракция не
содержала компонентов внутренней мембраны. Об этом свидетельствует
отсутствие в матриксе митохондрий активности антимицин-чувствительной
Н+ДН:цитохром с оксидоредуктазы (табл. 8).
8.4.2 Локализация полипептидов, иммунохимически родственных БХШ 310, в
субмитохондриальных фракциях озимой пшеницы
При определении локализации белков, иммунохимически родственных
субъединицам стрессового белка 310 кДа (БХШ 310), использовали
митохондрии побегов озимой пшеницы и полученные из них фракции
субмитохондриальных компонентов. Поиск данных белков в митохондриях
проводили при помощи ДДС-Еа-электрофореза с последующим вестерн -
блоттингом с антителами против БХШ 310 из озимой ржи. Результаты
экспериментов свидетельствуют, что в неразрушенных органеллах имеется ряд
полипептидов, иммунохимически родственных субъединицам БХШ 310. Это
полипептиды с мол. массой 60, 55 и 23 кДа (рис. 33). Эти полипептиды, как
показали эксперименты с обработкой митохондрий проназой Е, находятся
внутри митохондрий (рис. 33) (Побежимова и др., 2001; Kolesnichenko et
al., 2000b).
Таким образом, в митохондриях озимой пшеницы среди белков, прочно
связанных с органеллами, имеются полипептиды с мол. массой 60, 55 и 23
кДа, иммунохимически родственные субъединицам БХШ 310 озимой ржи.
Рассмотренные выше результаты свидетельствуют, что в митохондриях озимой
пшеницы имеются полипептиды, иммунохимически родственные субъединицам БХШ
310
71
озимой ржи. Причем, как оказалось, они прочно связаны с органеллами. В
связи с этим можно предположить, что среди этих белков есть такие,
которые локализованы в митохондриальных мембранах. Поэтому в дальнейших
исследованиях был проведен сравнительный анализ содержания белков,
иммунохимически родственных БХШ 310, в различных фракциях митохондрий:
во внутренней и
внешней мембранах и матриксе (Побежимова и др., 2001; Kolesnichenko et
