Стрессовый белок БХШ 310: характеристика и функции в растительной клетке - Колесниченко А.В.
ISBN 5-98000-005-4
Скачать (прямая ссылка):
al., 2000b).
M 1 2
Г Т
66 кД >
45 кД -> - ,
36 кД - -.
29 кД _
24 кД
20 кД -
Рис. 33. Вестерн-блоттинг элюированных ДДС-Na белков митохондрий 60
озимой птттенипыт с
55 антителами против БХШ
310 озимой ржи до (1) и после (2) обработки проназой Е. Слева 23
приведены1 мол. массы
маркеров.
66 кД
45 кД 36 кД-29 кД 24 кД
20 кД 14 кД-
М 1 2 3 4 5
Г
^ fS - ГГ5
N
66
60
58
55
23
Рис. 34. Вестерн-блоттинг элюированны1х ДДС-Na белков мембранных фракций
митохондрий озимой пшеницы с антителами против БХШ 310 озимой ржи.
1- внешняя мембрана;
2- внутренняя мембрана;
3- внутренняя мембрана, обработанная 1М KCl;
4- внутренняя мембрана, обработанная 1% Тритоном Х-100;
5- матрикс.
Слева приведены1 мол. массы маркеров.
72
Иммуноблоттинг элюированных ДДС-Na полипептидов мембранных фракций
митохондрий озимой пшеницы с антителами против БХШ 310 озимой ржи
показал, что в наружной мембране локализованы белки с мол. массами 60 и
58 кДа, иммунохимически родственные субъединицам БХШ 310 (рис. 34). Во
внутренней мембране митохондрий обнаружены полипептиды с мол. массами 66,
60, 55 и 23 кДа (рис. 34). Следует отметить, что белки 60, 55 и 23 кДа по
массе соответствуют полипептидам, выявляемым в неразрушенных
митохондриях, обработанных проназой Е. При этом полипептид с мол. массой
60 кДа 1М KCl из внутренней мембраны не экстрагировался и был заметен в
спектре и после обработки 1% Тритоном Х-100 (рис. 34), что
свидетельствует о его прочной связи с внутренней мембраной митохондрий.
Следует обратить внимание на появление в спектре после обработки 1М KCl
полипептида с мол. массой 58 кДа, который не был заметен во фракции
необработанных мембран (рис. 34). Можно предположить, этот белок
представлен во фракции внутренних мембран в незначительном количестве и
выявить его можно только после обогащения им белковой фракции вследствие
снятия с мембраны ряда непрочно связанных белков. Что касается белка с
мол. массой 23 кДа, то этот белок с мембраной связан непрочно, по-
видимому, электростатически (рис. 34). В матриксе митохондрий в
незначительном количестве обнаружены полипептиды 66 и 55 кДа (рис. 34).
Полученные результаты свидетельствуют, что значительное число
полипептидов, иммунохимически родственных субъединицам БХШ 310 озимой
ржи, локализовано в митохондриях озимой пшеницы в основном во внутренней
мембране.
На основании полученных выше результатов можно заключить, что
полипептиды, иммунохимически родственные БХШ 310, представлены в
митохондриях озимой пшеницы следующим набором: 66, 60, 58, 55 и 23 кДа.
При этом в наружной мембране митохондрий содержатся полипептиды 60 и 58
кДа, во внутренней мембране митохондрий - 66, 60,
73
55 и 23 кДа. В матриксе митохондрий присутствуют в следовых количествах
белки 66 и 55 кДа.
Таким образом, данные, полученные при изучении локализации
иммунохимически родственных БХШ 310 полипептидов в субмитохондриальных
фракциях вступают в противоречие с данными, полученными при определении
нативных митохондриальных белков. При анализе субмитохондриальных фракций
(рис. 33, 34) не обнаружено значительных количеств субъединиц БХШ 310,
присутствующего в спектрах нативных белков митохондрий (рис. 25). Можно
предположить, что этот факт связан с элиминацией данных полипептидов в
процессе очистки и неоднократного переосаждения митохондрий. Однако, в
этом случает БХШ 310 должен быть не интегральным белком мебраны, а
белком, непрочно связанным с наружной мембраной митохондрий, который
может диссоциировать в процессе очистки и неоднократного промывания
митохондрий.
9 СРАВНЕНИЕ БХШ 310 С ДРУГИМИ ИЗВЕСТНЫМИ СТРЕССОВЫМИ РАСТИТЕЛЬНЫМИ
БЕЛКАМИ: С
МИТОХОНДРИАЛЬНЫМ РАЗОБЩАЮЩИМ БЕЛКОМ PUMP И С ДЕГИДРИНАМИ
Электрофорез очищенного при помощи колоночной хроматографии стрессового
белка БХШ 310 показал, что он состоит из двух типов субъединиц с
молекулярными массами
56 и 66 кДа. В то же время изучение митохондриальных белков при помощи
вестерн-блоттинга с антисывороткой против БХШ 310 выявило во внутренней
мембране митохондрий лишь иммунохимически родственные субъединицам БХШ
310 белки. Поскольку было установлено, что в растениях имеются такие UCP-
подобные разобщающие белки, как PUMP, а молекулярная масса большей
субъединицы БХШ 310 близка к молекулярной массе димера PUMP (64 кДа),
была предпринята попытка при помощи вестерн-блоттинга установить, не
является ли БХШ 310 либо одна из его
74
субъединиц гомологом PUMP или иммунохимически родственным ему белком.
Анализ белка БХШ 310 при помощи антисыворотки против митохондриального
разобщающего белка PUMP, любезно предоставленной сотрудниками лаборатории
профессора А. Vercesi (Campinas, Бразилия), показал, что ни одна из
субъединиц БХШ 310 не реагировала с антителами против PUMP (рис. 35 А). В
связи с этим можно сделать вывод, что субъединицы БХШ 310 не родственны
этому митохондриальному разобщающему белку.
Рис. 35. (А) Вестерн-блоттинг общего митохондриального белка (1) и
