Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
микроскопии. Даже на данном этапе этот метод является исключительно
ценным при изучении очень больших молекул, таких, как ДНК. Некоторые
примеры применения электронной микроскопии будут обсуждаться в
последующих главах.
РАДИОАВТОГРАФИЯ ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ
Если радиоактивный образец поместить на фотоэмульсию, обладающую
соответствующими свойствами, то высокоэнергетические частицы, испускаемые
при радиоактивном распаде, будут воздействовать на фотоэмульсию. Свойства
ядерных фотоэмульсий таковы, что каждая частица вызывает образование
только одного или нескольких зерен серебра. Таким образом, после
определенного времени контакта с радиоактивным образцом и последующего
проявления расположение зерен серебра фотоэмульсии будет соответствовать
форде радиоактивной молекулы. Типичный пример радиоавтограммы ДНК
приведен на рис. 10.6.
Привлекательность этого простого метода заключается в том, что при его
применении не происходит существенных нарушений структуры молекулы.
Однако и он имеет два больших недостатка. Они обусловлены, во-первых,
конечным размером зерен серебра и, что более существенно, значительной
длиной пробега частиц. Последнее обстоятельство является причиной того,
что разрешение ухудшается до сотен ангстрем для 3Н, тысяч ангстрем для
14С и еще большей величины для 32Р. Второй недостаток заключается в
следующем: для получения изображения образца необходимо, чтобы произошло
несколько распадов на молекулу. Так что, если исследователь не обладает
исключительным терпением, он должен применять, короткоживущие изотопы.
При этом еще более серьезной проблемой является то, что радиоактивными
изотопами должна быть замещена существенная часть атомов молекулы.
Предположим, изучают ДНК такого размера, как ДНК Е. coli (мол. масса 2 •
109). Ее контур четко определит тысяча точек распада, равномерно
распределенных по длине молекулы. Если используют 32Р, время полураспада
которого равно 14 дням, и если экспозиция длится 14 дней, то в молекулу
ДНК должно быть включено 2000 атомов 32Р. Это соответствует удельной
радиоактивности 2,5 Ки • (ммоль Р)_ 1 (1 Ки = 2,2 • 1012 расп./мир). Это
достаточно высокая плотность излучения. Для приготовления образца
культуру Е. coli выращивают в среде с 32Р. При этом возникает опасность
радиационных нарушений не только в растущей клетке, но и в самой ДНК, в
которой могут появиться разрывы. Радиоавтография молекул высших
организмов еще более затруднена из-за большей чувствительности к
радиации.
Несмотря на эти трудности, радиоавтогроафия является мощным
дополнительным методом исследования ДНК. Она успешно применяется при
импульсной метке, когда наблюдается предпочтительное включение 32Р в
новосинтезированные области. Таким спо-
186
ГЛАВА 10
РИС. 10.6. Ралиоавтограмма реплицирующейся молекулы ДИК Е. coli. Около
10% исходной кольцевой двухцемочечной молекулы реплицировалось с
образованием двух дочерних дуплексов, благодаря чему и появилась
дополнительная петля вверху справа. Длина молекулы от начала до конца
0,65 мм. (С любезного разрешения д-ра Кэрнса.)
собом можно специфически исследовать структуру областей, участвующих в
репликации. Белки не столь удобный объект для радиоавтографических
исследований, как нуклеиновые кислоты, поскольку их атомы нельзя легко
заменить короткоживущими изотопами.
ДИФРАКЦИЯ РЕНТГЕНОВСКИХ ЛУЧЕЙ
Дифракция рентгеновских лучей, являющаяся важным методом исследования
макромолекул, подробно рассматривается отдельно в гл. 13 и 14. Здесь же
мы обсудим в общих чертах лишь некоторые результаты исследований
дифракции на монокристаллах. Рентгеноструктурный анализ позволяет
получить трехмерную картину регулярного распределения электронной
плотности в кристаллической решетке. Как правило, некоторую информацию о
размере и форме макромолекулы можно получить из симметрии кристалла, его
плотности и размера основного повторяющегося элемента (элементарной
ячейки). Во многих случаях получают также данные о числе субъединиц и
симметрии их взаимного расположения.
Разрешение на карте электронной плотности зависит от качества кристалла и
совокупности накопленных данных. В свою очередь уровень информации о
деталях структуры кристалла определяется разрешением карты электронной
плотности. При разрешении 10 А обычно бывает трудно заключить, где же
одна молекула в кристалле кончается, а другая начинается. Это понятно,
так как обычно небольшие белки имеют диаметр всего 30 А, а тесный
контакт- между макромолекулами в макромолекулярном кристалле не является
чем-то необычным. Пространственное распределение электронной плотности
отдельной молекулы белка или нуклеиновой кислоты можно определить при
разрешении 6 А. Это разрешение позволяет получить общее представление о
форме макромолекулы и таких характерных особенностях, как наличие в ней
углублений и карманов. Данные рентгеноструктурного анализа с таким
разрешением сравнимы с лучшими результатами, полученными с помощью фурье-
