Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
как, например, ферри-тин, имеющий в центральной части группу Fe203. Почти
всегда для наблюдения образца приходится прибегать к различным способам
его обработки, что приводит к существенной потере в разрешении.
Позитивное контрастирование заключается во введении тяжелых атомов в
образец. Это можно сделать с помощью специфического химического комплекса
(например, связывания ионов уранила с ДНК или фиксации осмием липидных
бислоев). Но чаще всего применяют способ оттенения. С раскаленной
проволоки, которая служит источником тяжелых атомов, вольфрам (или другой
тяжелый металл) напыляют на образец. Тяжелые атомы осаждаются на
поверхности как образца, так и пленки-подложки, которые расположены на
поддерживающей их сетке. Если напыление ведется под фиксированным углом,
атомы металла накапливаются перед образцом, тогда как непосредственно за
исследуемым объектом, там, куда на пленку-подложку не попадают атомы
металла, образуется тень (рис. 10.1, А). Размер тени определяется высотой
образца. Иногда образец вращают и при этом напыляют металл под малым
углом. В этом случае тень не образуется, но избыток металла скапливается
вблизи характерных вертикальных поверхностей структур, что и позволяет
выявлять их при наблюдении.
Вторым способом является негативное контрастирование. В данном случае
образец помещается в контрастирующий раствор, содержащий тяжелые атомы,
например в раствор уранилацетата. Рассеивающие тяжелые атомы заполняют
все пространство вокруг нерассеивающей макромолекулы, и поэтому на их
фоне становится возможным наблюдение макромолекулы в электронном
микроскопе (рис. 10.1, Б). К сожалению, это наблюдение нельзя назвать
прямым, так как реально получают изображение не самой макромолекулы, а
всей той рассеивающей области, где ее нет.
Перечисленные способы имеют свои недостатки. Для наблюдения в электронном
микроскопе исследуемый образец должен быть высушен и помещен в высокий
вакуум. В про-
РАЗМЕР И ФОРМА МАКРОМОЛЕКУЛ
179
Направление
оттенения
Направление
наблюдения
Направление
наблюдения
У
Б \ Сетка
РИС. 10.1. Схема обработки образцов для электронной микроскопии.
Коричневым цветом показан слой тяжелых атомов. А. Обработка образца по
методу оттенения. Б. Негативное контрастирование. d - длина тени, а -
угол оттенения, h = d ' tg о: - высота объекта; толщина слоя металла
пропорциональна sin /3.
цессе химического окрашивания тяжелыми атомами, процедуры довольно
грубой, возникает большая опасность нарушения структуры образца. Белки и
нуклеиновые кислоты при физиологических условиях содержат значительное
количество связанной воды. Как обсуждалось ранее, структура макромолекулы
в значительной степени определяется силами, зависящими от присутствия
воды. Ясно, что в условиях высокого вакуума электронного микроскопа
гидрофобные силы и гидратация должны сильно изменяться. Часто для
сохранения стуктуры макромолекулы в состоянии, близком к тому, в котором
она находится в водном растворе, применяют такие фиксирующие агенты, как
глутаральдегид, образующий поперечные сшивки. К сожалению, даже в этом
случае возможность нарушения стуктуры образца не исключена. К тому же
образец может сильно разрушаться под действием пучка электронов.
Для выявления возможных артефактов электронной микроскопии весьма полезно
непосредственное сравнение структуры макромолекулы в водном растворе с
данными электронной микроскопии. К сожалению, это далеко не всегда
реально, поскольку большинство молекул, структура которых подробно
изучена, слишком малы для точных исследований в электронном микроскопе,
тогда как макромолекулы, структура которых детально охарактеризована с
помощью электронного микроскопа, часто являются настолько большими, что
непригодны для изучения методами исследования в растворах, во всяком
случае для них нельзя получать этими методами столь же подробные сведения
об их строении. Сопоставление структур возможно для вирусов и некоторых
больших регулярных образований, таких, как микротрубочки и мышечные
волокна. Как правило, наблюдается хорошее качественное совпадение, что же
касается количественных данных, то они совпадают лишь в случае
определения размеров или способа упаковки субъединиц.
В настоящее время предпринимаются значительные усилия для
усовершенствования методов электронной микроскопии. Например, в
сканирующем электронном микроскопе
12*
180
ГЛАВА 10
высокого разрешения, разработанном Крю, можно различать упругое и
неупругое рассеяние электронов, благодаря чему достигается гораздо
больший контраст и появляется возможность наблюдать отдельные тяжелые
атомы. По мере усовершенствования метода, очевидно, станет доступным
увеличение контраста и для более легких атомов.
УМЕНЬШЕНИЕ ВЕРОЯТНОСТИ ПОЯВЛЕНИЯ АРТЕФАКТОВ, СВЯЗАННЫХ С ВЫСУШИВАНИЕМ И
УСАДКОЙ В ПРОЦЕССЕ ПОДГОТОВКИ ОБРАЗЦОВ ДЛЯ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ
Для исследования образцов, из которых растворитель полностью не
удаляется, был разработан ряд оригинальных методов. Одним из них является
