Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
метод замораживания-травления. Замороженный образец раскалывают ударом
ножа и затем лиофилизу-ют. При этом растворитель сублимирует, нелетучие
макромолекулы выступают из замороженного водного слоя, и в результате на
поверхности выявляется тонкая структура образца. Затем с помощью
специального источника на исследуемую поверхность напыляют атомы
углерода, благодаря чему создается тонкая углеродная пленка, являющаяся
репликой поверхности. Углеродную реплику осторожно отделяют от
поверхности и помещают на сетку электронного микроскопа. После оттенения
тяжелыми атомами реплику исследуют обычным способом в микроскопе. Внешний
вид образцов, приготовленных методом замораживания-травления или сходным
методом, часто значительно отличается от вида образцов, приготовленных
простым высушиванием на воздухе фиксированных образцов. Например,
рибосомы 70S, приготовленные методом замораживания-травления, имеют
размеры 170х 230 х 250 А и соответственно объем 5,1 ¦ 106 А3. Более
распространенный метод простого высушивания обычно дает размеры 160х 180
х 200 А и соответственно меньший объем 3,0 ¦ 106 А3. Данная ситуация
напоминает случай уменьшения объема при превращении сливы в чернослив,
причем оценить такое уменьшение довольно трудно.
Уменьшение объема образца происходит из-за коллапса его структуры в
результате удаления воды. Основной причиной этого служит поверхностное
натяжение воды, связанной с образцом. При высушивании остающаяся
связанной с образцом вода сжимает его,
так чтобы поверхность жидкости оставалась минимальной. Лиофильное
высушивание замороженного образца позволяет исключить его усадку. В
данном случае образец заморожен, и вода удаляется возгонкой. Однако сам
процесс замораживания может вести к структурным нарушениям, вызываемым
образованием кристаллов льда.
Другим способом подготовки образца является высушивание его при
температуре и давлении, соответствующих критической точке для данной
жидкости. В этих условиях наблюдается переход из одной фазы в другую,
здесь не происходит изменений объемов этих фаз, а поверхностное натяжение
жидкости становится равным нулю. Следовательно, жидкую фазу можно удалить
из образца без уменьшения его объема. К сожалению, критическая
температура для воды равна 374°С. Поэтому первое, что необходимо сделать,
это заменить воду образца (до высушивания его) на жидкость, имеющую более
низкую критическую температуру. Один из способов понижения критической
температуры заключается в переводе образца из водной среды
последовательно в этанол, амилацетат, а затем в жидкую двуокись углерода
(ее критическая температура равна 36,5°С). Такой способ, безусловно, таит
в себе опасность возникновения артефактов, обусловленных контактом
образца с органическими растворителями. Судя по всему, лучший способ
исключить артефакты - это готовить один и тот же образец различными
методами, принимая за достоверные те детали структуры, которые
наблюдаются в электронном микроскопе в образцах, приготовленных всеми
способами (рис. 10.2, 10.3).
РИС. 10.2. Изображение образцов гликогена печени в зависимости от способа
их обработки для электронной микроскопии. А. Негативное контрастирование.
Б. Образец высушен на воздухе и затем оттенен. В. Образец высушен
фильтрацией через агар и затем оттенен. Г. Образец заморожен, лиофильно
высушен и затем оттенен. Д. Замороженный образец лиофильно высушен, перед
оттене-нием выдержан в водных парах. Е. Гликоген в тонком срезе ткани
печени. (Микрофотографии любезно предоставлены Келленбергером, Виллигером
и Кистлером.)
182
ГЛАВА 10
I
т
%
К
50нм
РИС. 10.3. Изображение бактериофага Т4 в зависимости от способа обработки
образца для электронной микроскопии. От Д до 3 - изображения оболочек
бактериофагов, из которых удалена ДНК. А, Д. Негативное контрастирование.
Б, Е. Образцы высушены на воздухе и затем оттенены. В, Ж. Образцы
высушены в замороженном виде и оттеиены микрокапельиым методом (обратите
внимание на разрушение оболочки в Ж). Г, 3. Замороженный образец высушен,
оттенен предадсорб-циониым методом (отметьте лучшее изображение нитей
отростка по сравнению с другими оттененными образцами). (Микрофотографии
любезно предоставлены Кистлером, Тен-Хегелером и Кел-ленбергером.)
• ИСПОЛЬЗОВАНИЕ .СИММЕТРИИ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОГО
ИЗОБРАЖЕНИЯ
Разрешение и четкость электронной микрофотографии часто могут быть
улучшены методом усреднения. Предположим, объект исследования, например
базальная пластинка бактериофага Т4 (рис. 10.4, А), обладает простой
симметрией вращения. Тогда наложение повернутых относительно друг друга
микрофотографий должно исключить беспорядочный шум и сделать изображение
более четким.
РАЗМЕР И ФОРМА МАКРОМОЛЕКУЛ
183
Je
:sC.
A, f*4
В
РИС. 10.4. Электронная микроскопия базальной пластинки бактериофщ J Г4.
Вверху показана растянутая базальная пластинка (диаметр -500 А), ниже -
пластинка в сокращенном состоянии (диаметр - 550 A). [Crowther et al.,
