Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
молекулярной массы. В ряде случаев можно проанализировать равновесное
распределение взаимодействующих макромолекул и определить константу
связывания. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности является
чрезвычайно эффектив-
ГЛАВА 11
ным методом разделения макромолекул на основе различий в плавучей
плотности. Здесь равновесное распределение макромолекул устанавливается в
градиенте тяжелой соли типа CsCl, когда область изменения плотности
раствора заключает внутри себя точку, соответствующую плотности
макромолекул. По установлении равновесия макромолекулы оказываются в
узкой зоне, в центре которой плотность равна плавучей плотности.
Последняя не совпадает с плотностью собственно макромолекул из-за сложных
термодинамических эффектов трехкомпонентности, проявляющихся в
концентрированных солевых растворах, в которых обычно создается градиент.
Ширина зоны, где сконцентрированы макромолекулы, обратно пропорциональна
корню квадратному из значения молекулярной массы.
Задачи
11.1. Найдите скорость (в см/с), с которой медный шарик массой в 1 г (А)
будет погружаться в водоеме; (Б) будет двигаться в водном растворе при
центрифугировании со скоростью 1 об/мин на расстоянии 10 см от оси
вращения.
11.2. Предположим, что вы хотите определить коэффициент седиментации
вещества, присутствующего в малой концентрации и загрязненного массой
примесей. Вы, конечно же, не можете достоверно обнаружить это вещество
оптическими методами в ультрацентрифуге. Однако вы можете оценить его
количество каким-нибудь биохимическим способом, например "по числу крыс,
убиваемых 1 см3 раствора". Вы воспользовались ячейкой с механическим
разделением объема (рис. 11.20), в начале опыта заполненной раствором с
концентрацией cQ исследуемого вещества в единицах измерения
биохимического теста. В момент времени t' после начала центрифугирования
перегородка опускается вниз. (Считайте, что перемещение перегородки во
время центрифугирования не вызывает перемешивания раствора.) В момент
времени t, когда пройсходит торможение ротора, перегородка поднимается и
занимает положение хп (будем считать, что это происходит в области
плато). Раствор, который находится выше перегородки, после этого
перемешивается, и мы находим (опять посредством биохимического теста),
что после перемешивания концентрация вещества стала св. Выведите формулу,
которая позволит вычислить s, если из опыта известны и, t, хм, хп, св и
с0. Указание: все следует из принципа сохранения массы. (В настоящее
время такой подход применяют при центрифугировании активного фермента;
см. Cohen et al., 1967.)
11.3. Согласно данным, полученным с помощью электронного микроскопа,
фермент стрэйтаза (гипотетический) представляет собой вытянутый эллипсоид
вращения с отношением осей, равным 20. После титрования его избытком п-
хлормеркурибензоата (ПХМБ) коэффициент седиментации уменьшился в 1,58
раза, хотя и до и после титрования наблюдается всего одна седиментирующая
зона. Коэффициент диффузии увеличился после титрования в 2,52 раза.
а На сколько фрагментов распалась стрэйтаза под действием ПХМБ?
б. Рассчитайте величину отношения осей фрагментов.
в. Определите, какими, вероятнее всего, являются фрагменты - вытянутыми
или сплющенными - и изобразите схематически вероятную структуру
стрэйтазы.
11.4. У сферического белка с радиусом R (для безводной формы) коэффициент
седимента-ции = Предположим, что мы удалили сферическое ядро белка,
заключенное в пределах от г = 0 до т - R/2, и заменили его растворителем.
Как такая замена скажется на величине наблюдаемого w?
УЛЬТРАЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ
267
Время = 0 Время = t' Время =t
w = 0 u"0 и> =0
РИС. 11.20. Опыт с использованием ячейки с механическим разделением
объема .
11.5. После того как белок поместили в чистую DzO, молекулярная масса его
в результате замещения протоновувеличилась на 1,55*70. Пользуясь этими
сведениями, покажите, что можно определить V2 из сопоставления данных по
равновесному центрифугированию белка в D20 и Н20. Можно принять, что
объемы молекулы белка в Н20 и в D20 одинаковы.
ЛИТЕРАТУРА Общая
Freifelder D., 1976. Physical Biochemistry, W. H. Freeman and Company,
San Francisco (Фрайфель-дер Д. Физическая биохимия. - М.: Мир, 1980.)
Fujita Н., 1975. Foundations of Ultracentrifugal Analysis, Wiley, New
York.
Schachman H. K., 1959. Ultracentrifugation in Biochemistry, Academic
Press, New York.
Tanford C., 1961. Physical Chemistry of Macromolecules, Wiley, New York.
(Тенфорд Ч. Физическая химия полимеров. - М.: Химия, 1965.)
Van Holde К. Е., 1975. Sedimentation analysis of proteins. In: The
Proteins, 3d ed., ed. H. Neurath and R. Hill, Academic Press, New York,
1, 228.
Специальная
Adams E. T, Jr. 1967. Analysis of self-association systems by
sedimentation equilibrium experiments, Fractions, Beckman Instruments,
Inc., no. 3, p.l.
Bloomfield V., Crothers D., Tinoco I., Jr., 1974. Physical Chemistry of
Nucleic Acids, Harper & Row, New York.
