Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
от х, и эффектами неидеальности здесь пренебречь нельзя. Вообще следовало
бы начать с того, что и уравнение (11.49) является приближенным. Но не
обращая пока внимания на эти осложнения, видим, что уравнение (11.71)
предсказывает параболическое распределение концентрации растворенного
вещества. Это означает, что при равновесии устанавливается градиент
плотности. Согласно уравнению (11.71), др/дх ос дс3/дх ос и2х. На
практике, используя соли тяжелых металлов типа CsCl, можно создать
градиент с перепадом плотности более чем 10% в обыкновенной пробирке для
центрифугирования при максимальных скоростях современных ультрацентрифуг.
Теперь посмотрим, что получится, если перед началом центрифугирования
добавить небольшое количество макромолекул в солевой раствор. Если
плотность макромолекул (компонент 2) превышает максимальную плотность
CsCl в основании градиента, то они образуют осадок на дне пробирки. Если
их плотность меньше минимальной плотности CsCl, то они всплывут на
поверхность. Если же их плотность попадает в диапазон изменения
градиента, то они соберутся в зоне, где плотность такова, что коэффициент
(1 - V2p) равен нулю (рис. 11.19). Зная распределение плотности вдоль
пробирки, можно определить плотность (а тем самым и У2) макромолекул по
их положению в ячейке. В центре зоны V~1 просто равен плотности р0
раствора в данной точке. Эта плотность называется плавучей плотностью.
Описанным способом можно разделить в препаративной центрифуге смесь
макромолекул разной плотности. Казалось бы, разрешающая способность
метода должна быть очень высокой, так как в принципе можно создать весьма
пологий градиент плотности. Поэтому нам важно знать, какие факторы
определяют ширину зоны, содержащей макромолекулы.
УЛЬТРАЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ
261
х
А Б
РИС. 11.19. Равновесное центрифугирование малого количества ДНК в
градиенте CsCl. А. Распределение плотности в начале опыта. Б.
Распределение плотности после установления равновесия. (Szybalski,
Fractions, Beckman Instruments, Inc., no. 1, p. 1, 1968.)
Пренебрегая и далее термодинамическими эффектами трехкомпонентности,
рассмотрим чисто физический градиент плотности. В области, где находятся
макромолекулы, мы можем представить плотность в виде ряда Тэйлора:
р(х) = р0 + (х - x0)(dp/dx)Xo (11.72)
гдех0 - положение центра равновесной зоны, в которой собраны
макромолекулы. Подставим это выражение в уравнение (11.48), определяющее
равновесное распределение макромолекул. Пренебрегая поправками на
неидеальность, получим
М2(1 - ^2){|>о + (* - = {RT'cj2)(l/c2)(dc2/dx) (11-73)
Это уравнение можно упростить, если учесть, что У2Р0 = 1- Введя у = х -
х0 и dy = dx, мы можем переписать уравнение (11.73) в виде
г/(1п сг) = (-M2w2/RT)(dp/dx)X0V2(y2 + x0y)dy (11.74)
Поскольку у много меньше х0, член с у2 можно опустить. Интегрируя от у =
0 до у = х и заменяя у нах - х0, получим
с2(х) = с2(х0) ехр[ -(х - Х0)2/2<Т2] (11.75)
Таким образом, распределение макромолекул в градиенте плотности имеет
гауссову форму с шириной зоны, характеризуемой величиной стандартного
отклонения а, которая определяется по формуле
о2 = RTfM2V2cj2x0{dp/dx)Xu (11.76)
• ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ В ГРАДИЕНТЕ ПЛОТНОСТИ: ТРЕХКОМПОНЕНТНАЯ ТЕОРИЯ
Для того чтобы правильно решить задачу о равновесии в градиенте
плотности, необходимо выразить в явной форме термодинамические
соотношения, описывающие поведение всех трех компонентов. Молярная
концентрация макромолекул достаточно велика, и ее
262
ГЛАВА 11
влияние приходится учитывать. Избирательное взаимодействие между
компонентами 2 и 3 может изменить градиент плотности, форму распределения
в зоне и значение кажущейся плавучей плотности Это весьма сложная
задача, и мы очертим ее здесь лишь приб-
лизительно.
Начнем с общего феноменологического описания потока /-го компонента в
трехкомпонентной системе [см. уравнение (10.38)]:
Ji= I LijXj (П-77)
j=i
где Xj - обобщенная сила, действующая на компонент j. Во время
центрифугирования, как мы знаем [из сопоставления уравнений (11.77) и
(11.29)], сила, действующая на j-й компонент, равна
Xj = ш2 х - дfij/dx (11 -78)
При наличии механического и теплового равновесия эти силы должны быть
равны нулю. Следовательно,
ш2х = аД;/йх (11.79а)
Градиент химического потенциала компонента j можно найти тем же путем,
каким это было сделано ранее в случае двухкомпонентной системы [уравнения
(11.30) и (11.31)]. В результате уравнение (11.79а) можно переписать в
следующем виде:
з
* (1 - Vjp)co2x= ? (dfij/dc^idCi/dx) (11.796)
i= 1
При центрифугировании в градиенте плотности третий компонент присутствует
в виде концентрированного раствора тяжелой соли типа CsCl. Найдем сначала
выражение для градиента плотности, создаваемого этим компонентом. Такой
градиент может возникнуть из-за изменения концентрации и за счет
давления:
dp dx = (i'pCii x) + (срр/дх) (11.80)
Будем считать, что химический потенциал компонента 3 не зависит от
концентраций компонентов 1 и 2, тогда
