Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
медленного, всегда присутствуют совместно с другими. Это также означает,
что седиментация в том виде, в каком она описана до сих пор, недостаточно
эффективна как метод разделения или очистки компонентов, кроме тех
случаев, когда их скорости седиментации сильно различаются.
Метод зонального центрифугирования свободен от обоих указанных
недостатков. Раствор макромолекул наносят тонким слоем на поверхность
растворителя, занимающего
УЛЬТРАЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ 249
гораздо больший объем. При аналитическом ультрацентрифугировании это
можно сделать с помощью вкладыша для наслоения (рис. 11.16, А), который
принципиально не отличается от вкладыша в упоминавшейся ранее ячейке для
создания искусственной границы. Смесь, состоящая из нескольких
компонентов с различными коэффициентами седиментации, быстро разделяется
на отдельные зоны, которые перемещаются каждая со своей скоростью
седиментации. Из-за диффузии каждая зона несколько расплывается и
теоретически должна иметь гауссову форму (уравнение Б из Дополнения
10.3). В действительности концентрация в зоне распределяется более
сложным образом. Поскольку ускоряющая сила возрастает как оАс, передняя
часть зоны движется быстрее, чем задняя. Кроме того, на форму
распределения молекул внутри зоны влияет также зависимость скорости
седиментации от концентрации. Тогда как в передней и задней частях зоны
концентрация мала, и там молекулы движутся быстро, в середине зоны
концентрация гораздо выше, и здесь их скорости меньше. В результате зона
имеет широкий передний и узкий задний фронт (рис. 11.16, Б).
Отметим одно из главных достоинств метода зонального центрифугирования.
Оно заключается в том, что весь исследуемый биологический материал
сконцентрирован в не-
После продолжительного центрифугирования
До наслоения
После васлоения
РИС. 11.16. Зональное центрифугирование. А. Вкладыш для наслоения.
Схематически показано, как происходит наслоение и разделение. Вкладыш
работает по тому же принципу, что и ячейка для создания искусственной
границы, изображенная на рис. Il.l4.i4. (Vinograd, Bruner, Fractions,
Beckman Instruments, Inc., no. 1, p 2, 1966.) Б. Распределение в ячейке
концентрации растворенного вещества (штриховая линия) и обшей плотности
раствора (сплошная линия) в отсутствие стабилизирующего градиента
плотности. В. Те же распределения при наличии стабилизирующего градиента
плотности.
х
250
ГЛАВА 11
большом объеме, и это значительно увеличивает чувствительность метода.
Для зонального центрифугирования требуется гораздо меньше материала, чем
для других методов; так, для получения обнаружимой зоны достаточно менее
1 мкг ДНК.
Зональная седиментация была бы невозможна в гомогенном растворе из-за
эффектов гравитационной неустойчивости. В зоне с исследуемым материалом
плотность была бы больше, чем в слоях раствора, расположенного ниже, и
вся масса той части раствора, где находится зона, попросту соскользнула
бы на дно. Например, плотность раствора ДНК с концентрацией 0,01 мг/мл
была бы примерно на 2 ¦ Ю-5 г/см3 больше плотности растворителя. Это
различие в плотности, однако, усиливается в силовом поле в 4 ¦ 105#,
типичном для ультрацентрифуги. Такая ситуация приблизительно эквивалентна
попыткам заставить ртуть держаться иа поверхности воды. Хорошо известно,
чем закончатся эти попытки.
Чтобы преодолеть эту трудность, необходимо создать градиент плотности.
Это можно осуществить и в умеренно разбавленных солевых растворах,
применяемых в аналитическом ультрацентрифугировании, если исследуемый
материал первоначально находится в более разбавленном растворе. Когда
слой с исследуемым материалом нанесен на поверхность основного объема
растворителя, из-за быстрой диффузии малых молекул образуется пологий
градиент плотности (рис. 11.16, Б). Перепад плотности от мениска до дна
ячейки может составлять всего 1Щ, так что это почти не влияет на скорости
седиментации. При центрифугировании градиент остается стабильным (и даже
увеличивается), поскольку молекулы соли имеют ббльшую, чем у воды,
плотность. Большие силы в ультрацентрифуге могут влиять даже на небольшие
ионы. Однако градиенты в разбавленных солевых растворах недостаточно
стабильны вне центрифуги. Если вы захотели бы извлечь очищенный материал
соответствующей зоны, вам пришлось бы отсасывать его, пока ротор еще
крутится. Это возможно, но в большинстве случаев существует более простое
решение.
Препаративное зональное центрифугирование применяют в основном как метод
очистки. При этом пользуются заранее сформированным градиентом
концентрации относи-
РИС. 11.17. Прибор для получения линейного градиента плотности.
Предполагается, что все то время, пока прибор работает, в правом сосуде с
помощью мешалки обеспечивается гомогенность раствора.
УЛЬТРАЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ
251
тельно вязкого вещества, взятого в качестве ингредиента раствора. Обычно
применяют линейный градиент сахарозы с диапазоном изменения концентрации
