Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
преобразований получим
</(In w,)/d(ln сп) = IM,/Mw(cn)] - 1 (11.64)
Можно проинтегрировать равенство (11.64) на отрезке между двумя точками в
ячейке, х0 и х:
,спМ
In[w,Cx)/w, (*(>)] = j (IM,/Mw(cn)] - l}(rfcn/c^ (11.65)
Для того чтобы мы могли использовать это уравнение, нужно, чтобы
полученные данные захватывали область столь низких концентраций, что
сп(Хо) г 0. Тогда h'jCxq) = 1. Мы можем получить сп(х) непосредственно из
опыта по равновесному центрифугированию, а Mw(x) - с помощью уравнения
(11.54), после чего нетрудно рассчитать A/W(cn). Таким образом, если
известна Л/, из независимых источников, можно получить In и, для любого
значения х в ячейке графическим интегрированием зависимости
([Л/,/A/w(cn)] - 1) с~1 от
УЛЬТРАЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ
259
сп. Далее константу равновесия можно вычислить по формуле
к = (1 - w,). wj с" (11.66)
В более сложных случаях равновесия требуются более сложные расчеты, но в
итоге получаются аналогичные результаты. Равновесное центрифугирование
представляет собой отличный метод исследования макромолекулярных
комплексов. В реальных случаях, однако, приходится пользоваться более
сложными уравнениями, чем уравнение (11.65), в которых учитывается
поправка на неидеальность.
АНАЛИЗ ПРИБЛИЖЕНИЯ К РАВНОВЕСИЮ
Равновесное центрифугирование - чрезвычайно эффективный метод, но
проведение измерений занимает очень много времени. Даже при небольшой
высоте столба жидкости для установления равновесного распределения
вещества с мол. массой 500 ООО требуется день или два, а для вещества с
мол. массой 50 ООО - несколько часов. Многие исследователи предпочитают
пользоваться результатами анализа низкоскоростных седиментационных
измерений, не дожидаясь установления равновесия. Такого рода данные
представлены на рис. 11.18 в промежуточные моменты времени. В 1947 г.
Арчибальд, который много лет занимался поисками решений уравнения Ламма,
заметил, что в области мениска и у дна ячейки уравнение потока имеет
тривиальное решение для любого момента времени в течение всего
седиментационного опыта. У мениска и на дне ячейки J2 должен быть равен
нулю, потому что через эти поверхности не может происходить переноса
вещества. Данный эффект не представляет интереса при больших скоростях
ротора, так как в этом случае у мениска вообще не оказывается вещества, а
на дне образуется плотный осадок. При малых скоростях, однако, приравняв
нулю выражение для J2 [уравнение (11.4)], имеем
to2s/D = (дс2/дх)(11'хс2) (11.67)
только для х = Хд или х = хм.
Подставляя выражения для s и D, можно записать
Мм = [RT/(l - V2pWWc2/dx)xJ,\/xMcM) (11.68а)
Мд = [RT/{\ - V2pW-]{dc2/dx\{\/xRc^ (11.686)
где см и сд - концентрации соответственно у мениска и у дна. С помощью
этих формул можно получить две оценки макромолекулярной массы для любого
момента времени, если мы сумеем измерить концентрацию растворенного
вещества и градиент его концентрации вверху и внизу. Для гомогенного
вещества оба значения молекулярных масс должны совпадать. Таким образом,
метод Арчибальда - хороший тест на гомогенность препарата.
Трудность использования уравнений (11.68) заключается в трудности
измерения одновременно и концентраций, и градиентов. Если мы
воспользуемся абсорбционной оптикой, то получим концентрации, которые
приходится дифференцировать с помощью численных методов, чтобы получить
градиенты. Такая процедура увеличивает погрешности экспериментальной
зависимости концентрации от расстояния, что отразится на точности
измерений. Здесь более пригодна шлирен-оптика, позволяющая осуществлять
прямые измерения градиента. Тот факт, что в ячейке сохраняется область
плато, упрощает расчет концентраций у дна и у мениска по данным,
полученным с помощью шлирен-системы. Мы всегда можем написать
см = сп - j " (дс/дх) dx (11.69а)
17*
260
ГЛАВА 11
Л
сд = Сп + j (дс/дх) dx (11.696)
*п
Учитывая весь материал междухм ихп или между хп ихд и используя принцип
сохранения массы, можно показать, что
См = С0 - (1 /•*")[ х2 (дс/дх) dx (11.70а)
¦*д
сд = с0 + (1/*д)| х2 (дс/дх) dx (11.706)
*п
где с0 - начальная равномерная концентрация растворенного вещества. При
отсутствии плато можно воспользоваться более сложными способами расчета
(см. Schachman, 1959). Любой из этих методов для случая переходного
состояния дает возможность быстро определить величину молекулярной массы.
ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ В ГРАДИЕНТЕ ПЛОТНОСТИ:
УПРОЩЕННАЯ ТЕОРИЯ
Предположим, что концентрированный раствор низкомолекулярного вещества
центрифугируют при больших скоростях до тех пор, пока не установится
равновесие. Согласно уравнению (11.49), малые молекулы растворенного
вещества (компонент 3) перераспределятся в ячейке точно так же, как и
большие. Используя мениск в качестве точки отсчета и разлагая в ряд
экспоненту в уравнении (11.49) ввиду малости М, получим
с3(х) = 1 + [Мз(1 - Г3р)ш2/2ЯТ](х2 - х2м) (11.71)
Это приближенная формула, так как в концентрированном растворе р зависит
