Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
ходится на долю 14С, а остальное число обусловлено 3Н, как показано в строке 4. Поскольку в канале Б фактически нет3Н, все количество этого изотопа находится в канале А, что дается в строке 5. Общее количество ИС определяется суммой 14С в каналах А и Б — строка 6. Соотношение 3Н и 14С можно подсчитать в строке 7. Заметим, что простота расчета становится возможной при таком выборе L2, чтобы импульсы 3Н не попадали в канал Б. Следует также помнить, что при большом избытке 14С определение ЭН становится неточным. Предположим, например, что 14С содержится в 20 раз больше, чем 3Н. В этом случае 14С в канале А будет 20*333 = 6660 и общая радиоактивность, регистрируемая в канале А, составит 6660+167 = 6827 имп/мин. Значение 3Н будет получено при вычитании 6660 из 6827.
Чтобы понять, в чем заключается трудность при вычитании больших чисел, рассмотрим статистику счета. В соответствии с теорией статистики стандартная ошибка измерения равна N1/2, где N — общее число импульсов (не имп/мин). Отсюда следует, что существует вероятность, равная 68%, что «истинное» значение лежит в пределах N±:N1^2. Если образец из примера с 20*14С считать одну минуту, 3Н будет получаться из разности между 6827±82 и 6660±81, т. е. в пределах от 4 до 330 имп/мин. Ясно, что ошибка огромна. Если же такой образец считать 10 мин, разность составит (68270+261) — (66600±259) и значение радиоактивности 3Н в этом случае может колебаться в пределах от П5 до 219 имп/мин; это уже лучше, но ошибка еще велика. При соотношении 3Н/|4С, данном в примере, при счете в течение 10 мин радиоактивность 3Н будет составлять от 164 до 180 имп/мин.
Чтобы показать ценность техники двойной метки, дополним условия примера. Предположим, что 3Н включен в остаток лейцина с удельной радиоактивностью 5 Ки/ммоль, а 14С — в остаток тирозина с удельной радиоактивностью 4 Ки/ммоль. Примем, что эффективность счета для 3Н и |4С составляет 30 и 90% соответственно. Отсюда действительные значения радиоактивности для 3Н и 14С (измеренная радиоактивность/эффективность счета) составят 167/0,30 и 1133/0,90, т. е. 556 и 1259 имп/мин соответственно. Следовательно, так как количества лейцина и тирозина •определяются по соотношению (количество метки)/(удельная радиоактивность), молярное соотношение лейцина и тирозина составляет (3Н/14С) * (удельная радиоактивность тирозина/удельная радиоактивность лейцина) = (556/1259) * (4/6) =0,353.
В примере 5-А принимается, что распределение радиоактивности между каналами А и Б для 3Н в экспериментальном и стандартном образцах одинаковое, причем это справедливо и для 14С. При этом подразумевается, что тушение либо отсутствует, либо имеет одно и то же значение как для эксперименталь-
ного, так и для стандартного образцов. Если же это не соблюдается, возникает небходимость определения относительных степеней тушения. Как будет видно из раздела, посвященного приготовлению образцов это может представлять серьезную проблему в случае образцов с двойной меткой. Следовательно, нельзя не подчеркнуть особо то, что стандарты должны быть приготовлены тем же самым образом, что и образцы, содержащие двойную метку. Новички обычно совершают общую ошибку, используя стандарты, изготовляемые фирмами — производителями счетчиков для определения соотношения радиоактивностей в каналах. Эти стандарты чаще всего представляют собой радиоактивный толуол, растворенный в обычном толуоле в атмосфере аргона, т. е. условия приготовления стандарта практически исключают тушение— случай, который почти никогда не имеет места на практике.
Приготовление образцов
Метод приготовления образца может оказывать большое влияние на эффективность счета.
При использовании счетчика Гейгера — Мюллера образец обычно помещают на алюминиевый диск, называемый подложкой, и высушивают, если он является жидкостью. Нерастворимые образцы часто собирают на поверхности тонкого мембранного фильтра (гл. 7) и приклеивают на подложку. Принципиальной проблемой при подготовке образцов для счетчика Гейгера — Мюллера является самопоглощение; в том случае, когда образец достаточно толст, многие р-частицы теряют способность достигать счетчика, поскольку они поглощаются уже в самом образце, или они теряют столько энергии, что уже не в состоянии ионизировать газ в счетчике. Для р-частиц с достаточно высокой энергией (например, в случае 32Р) самопоглощение практически не является проблемой; для 14С самопоглощение может стать заметным в образцах с массой более 1 мг; для 3Н оно настолько велико, что практически исключает применение счетчиков Гейгера — Мюллера. Трудности, связанные с самопоглощением, можно обойти, если использовать образцы различной толщины (т. е. различного объема) и определять скорость счета на единицу объема для каждого из них для того, чтобы выяснить, пропорционален ли счет объему. Если этого не наблюдается, строят график зависимости радиоактивности от объема, который далее используют для коррекции получаемых результатов. Как это делается, показано на рис. 5-6. Иногда к образцу бывает необходимо добавить идентичное соединение с высокой радиоактивностью для того, чтобы определить скорость счета и получить статистически достоверную корректировочную кривую.
