Вирусология: В 3-х т. Том 1 - Филдс Б.Н.
ISBN 5-03-000283-9
Скачать (прямая ссылка):
Молекулы ДНК можно также вводить в клетки микроинъ-екцией под давлением [1, 10] или ионофорезом [67]. Введение молекул ДНК в оплодотворенные ооциты может приводить к включению вирусной ДНК В клеточный геном и стабильному наследованию этих генов в последующих поколениях [33, 34].
Введение клонированных вирусных генов в родительский вирусный геном
Чтобы убедиться в функциональной активности вирусного гена, клонированного в рекомбинантной молекуле ДНК, он должен быть вновь включен в -родительский геном. Некоторые клонированные молекулы вирусных ДНК -не обладают биологической активностью [32, 51, 119]. Можно также перестроить in vitro соответствующую последовательность или ввести в иве мутацию,, а затем включить мутантную форму молекулы в родительский генам. Методы введения мутаций in vitro рассматриваются в. последующих (разделах.
Из клонированных генов паповавирусов можно легко получить инфекционный геном [92]. Рекомбинантные ДНК расщепляют по сайтам, соединяющим вирусные и плазмидные ДНК, лигируют при низких концентрациях ДНК (для того чтобы стимулировать автолигнрование), а затем трансфицируют ими чувствительные или пермиссивные клетки. У паповавирусов некоторые плазмидные векторы допускают репликацию ДНК с использованием вирусного сигнала начала репликации, и поэтому при трансфекции молекулы рекомбинантной ДНК могут реплицироваться [69]. Однако эти молекулы слишком велики, для того чтобы упаковываться в вирионы, и поэтому инфекционные вирионы не образуются.
Обратное введение клонированных субгеномных частей вирусных линейных ДНК-геномов более сложно. Во многих случаях для этого применяют метод спасения маркера, модифицированный для использования очищенных в геле фрагментов ДНК [60, 131]. Термин «спасение маркера» исходно указывал еа то, что генетический маркер в инактивированном вирусе или фрагменте ДНК был бы утрачен, если бы не рекомбинировал с активным геномом или полноразмерной молекулой ДНК. Таким образом, спасение маркера может быть легко выявлено, если донорные молекулы придают фенотип, отличный от фенотипа реципиентного вируса. Чтобы определить место внедрения до-норной молекулы ДНК, она должна генотипически отличаться от реципиентного генома. Часто для сообщения /s-мутантам /5+-фенотипа используют фрагменты ДНК дикого типа [60, 131]. В случае герпесвирусов и аденовирусов клонированные фрагменты ДНК смешивают с полноразмерными инфекционными ДНК и совместно трансфицируют ими клетки хозяина (рис. 8.1). Рекомбинация между молекулами двух типов проходит in vivo. После этого идентифицируют и отбирают вирусное потомство, которое получило маркеры дикого типа. В случае поксвирусов фрагменты ДНК вводят в клетки, которые заражают мутантными вирионами, поскольку поксвирусная ДНК неинфекционна. Не-
Фрагменты вирусного генома дикого типа
¦ S _
Мутантный геном
Совместная
трансфекция
Рекомбинация in viro
Геном Г5+-реком-бинанта
Рис. 8.1. Спасение маркера при совместной трансфекции молекулами вирусной ДНК. Показаны этапы спасения маркера с использованием ДНК-генома температурочувствительного мутанта и фрагментов вирусной ДНК дикого типа. Смешивают интактные молекулы мутантной ДНК с полным гидролизатом или индивидуальными фрагментами вирусной ДНК дикого типа, после чего проводят трансфекцию клеток. В зараженных клетках происходит рекомбинация между молекулами двух типов. После этого дочерние вирусы проверяют на наличие ^-рекомбинантов [60, 131]. -
смотря на различие в способе введения, в клетке хозяина молекулы поксвирусной ДНК двух типов могут рекомбинировать.
Для «ведения клонированных вирусных фрагментов в инфекционный геном иногда можно использовать рекомбинацию in vitro (рис. 8.2). Для этого отбирают аденовирусные геномы, содержащие всего несколько сайтов расщепления рестрикцион-
Трансфекция
Дочерний вирус дикого типа
ДНК аденовируса d!303
Рис. 8.2. Реконструкция адено!Вируса дикого типа из мутантной вирусной ДНК и рекомбинантной плазмиды. Рекомбинантная плазмида содержит левый конец (от 0 до 4,5 единиц карты) аденовирусной ДНК, вставленный по Pstl-сайту плазмиды pBR322. Аденовирусная часть ДНК плазмиды, представляющая собой геномную последовательность ДНК ог левого конца до сайта расщепления рестрикционной эндонуклеазой Hpal в районе 4,5 единиц карты, была вставлена в PsfI-сайт при помощи создания «хвостов» poly (G)—poly (С). Рекомбинантную плазмиду расщепляли рестриктазами Pstl и Xbal. ДНК аденовируса dl309 расщепляли рестриктазой Xbal. Большой фрагмент (от 3,8 до 100 единиц карты) лигировали с гидролизатом плазмиды, и лигазной смесью трансфицировали трансформированные аденовирусом клетки человека. Дочерний вирус образовывал бляшки на клетках HeLa и трансформированных аденовирусом клетках человека. Таким образом, дочерний вирус включил в свой состав фрагмент последовательности ДНК дикого типа от 0 до 3,8 единиц карты [129].
Рис. 8.3. Спасение маркера при образовании частичного • гетеродуплекса. Этот метод широко применяли для вируса SV40 [62]. В геномную ДНК ifs-мутанта вносили одноцепочечный разрыв, приводящий к переходу ДНК в форму II. Вирусную ДНК дикого типа расщепляли на множество фрагментов. Молекулы денатурировали и отжигали для образования частичных гетеродуплексов.. Этой ДНК трансфицировали клетки, в которых неспаренные основания подвергались репарации, а одноцепочечные участки застраивались. Репарация проходит либо по одной, либо по другой цепи, поэтому образуются как мутанты, так и потомство дикого типа. (Рисунок приводится с разрешеняя из работы [62].)
