Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Филдс Б.Н. -> "Вирусология: В 3-х т. Том 1 " -> 102

Вирусология: В 3-х т. Том 1 - Филдс Б.Н.

Филдс Б.Н., Найп Д.М., Мэрфи Ф.А., Харрисон С. Вирусология: В 3-х т. Том 1 — М.: Мир, 1989. — 492 c.
ISBN 5-03-000283-9
Скачать (прямая ссылка): virusologiyat11989.djvu
Предыдущая << 1 .. 96 97 98 99 100 101 < 102 > 103 104 105 106 107 108 .. 224 >> Следующая

ными эндонуклеазами. Например, муга-нт dl309 аденовируса типа 5 имеет только -один сайт расщепления Xbal .в точке, соответствующей 3,8 единиц жарты вирусного генома [57]. После клонирования левого конца аденовирусного генома от 0 до 4,5 единиц карты [129] вирусную вставку из рекомбинантной плазмиды расщепляли и лигировали с ДНК dl309, разрезанной Xbal. Лигированной смесью трансфицировали клетки человека, трансформированные аденовирусом, и собирали урожай вируса. Полученный вирус образовывал бляшки на клетках HeLa, следовательно, он содержал 'клонированные фрагменты ДНК дикого типа. Интересно, что клонированные нуклеотидные последовательности, лигированные с ДНК dl309, содержали как результат процедуры клонирования участок poly(dG) :poly(dC), тогда как полученный вирусный геном не содержал этих последовательностей. Таким образом, аденовирус, вероятно, обладает механизмом, позволяющим восстанавливать один из концевых повторов [128, 1291.
Введение фрагментов вирусных ДНК в кольцевые молекулы вирусных ДНК также может осуществляться путем лигирования in vitro [11] или образования in vitro частичного гетеродуплекса [62]. В последнем варианте случайная репарация неспаренных оснований приведет к включению новой последовательности в инфекционный геном (рис. 8.3).
Приведенные примеры показывают, каким образом клони-
рованные ДНК дикого типа могут быть введены в мутантный геном. Ниже обсуждается обратная ситуация, когда мутированные фрагменты вводят в геном дикого типа с образованием специфического мутантного генома.
Использование вирусных геномов в качестве векторов
Некоторые вирусные геномы после соответствующей перестройки приобретают способность служить векторами для репликации и экспрессии эукариотических генов. Этот вопрос подробно разработан во многих обзорах [19, 28, 103, 104], где описано, как можно использовать вирусы в качестве векторов для вирусных и для клеточных генов. К настоящему времени наиболее широко используемой вирусной системой является SV40. Молекула ДНК этого вируса была первой ДНК вирусов эукариот, для которой удалось определить последовательность оснований. Кроме того, молекулярная биология SV40 изучена более детально, чем какого-либо другого. Первые конструкции содержали несколько различных генов. Рекомбинантные молекулы реплицировались в эукариотических клетках, но мРНК не синтезировалась и экспрессии белка не наблюдалось [31]. Позднее стало понятно, что мРНК SV40 подвергаются сплайсингу [6, 43, 45], и, когда вставленные ДНК, кодирующие глобин, были ориентированы таким образом, чтобы мог происходить сплайсинг, была обнаружена экспрессия глобина [44, 87].
Чужеродную ДНК можно ввести в SV40 либо в раннюю, либо в позднюю области генома (гл. 26). При введении генов в позднюю область обычно наблюдают более высокий уровень экспрессии, так как поздний промотор более активен. Поскольку для вируса необходимы и ранние, и поздние белки, внедрение чужеродного гена приводит к образованию дефектного вирусного генома, и поэтому для сохранения рекомбинантной молекулы требуется вирус-помощник. Кроме того, максимальный размер генома SV40, который может быть упакован в вирионы, не должен значительно превышать 5243 пар оснований (Ьр), что соответствует нормальному -размеру генома этого вируса. Таким образом, имеются ограничения на размер вставки ДНК в рекомбинантный геном, если последний должен упаковываться и сохраняться в вируаных частицах.
Другим подходом к использованию репликона SV40 была разработка клеточных линий, конститутивно экспрессирующих Т-антиГен SV40 и другие факторы, необходимые для репликации ДНК SV40. Эти линии, названные клетками COS, получены трансформацией клеток CV-1 геномом SV40, который имел дефектный участок начала репликации [29]. Полученная клеточная
ливия содержит последовательности SV40, которые не могут реплицироваться, но экспрессируют ранние вирусные продукты. Прямое 'введение рекомбинантных молекул ДНК, содержащих участок-начала репликации SV40, приводит к репликации рекомбинантной молекулы в этих клетках. Таким образом, они служат эффективной системой для исследования экспрессии трансфицированных рекомбинантных молекул (см. след, раздел). Кроме того, рекомбинантные молекулы, содержащие вставленные в раннюю транскрипционную область чужеродные фрагменты ДНК» могут пассироваться в виде чистых рекомбинантных молекул, поскольку вирус-помощник не требуется.
Векторы на основе SV40 способны экспрессировать как вирусные, так и клеточные гены, например гены р-глобина «ролика [87], а- и р-глобинов мыши [44, 46], препроинсулина [41], поверхностного антигена HBV [85], белка G VSV [110] и гемагглютинина вируса гриппа [25, 47, 133]. Поскольку гены большего размера нельзя клонировать в геноме SV40, в качестве альтернативных вирусных векторов использовали вирусные геномы большего размера. Для экспрессии больших количеств Т-анти-гена SV40 использовали аденовирусы [125, 136]. Рекомбинанты получали отбором аденовирусов на способность расти в клетках обезьян с последующей идентификацией тех из них, которые экспрессируют Т-антиген SV40.
Предыдущая << 1 .. 96 97 98 99 100 101 < 102 > 103 104 105 106 107 108 .. 224 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed