Вирусология: В 3-х т. Том 1 - Филдс Б.Н.
ISBN 5-03-000283-9
Скачать (прямая ссылка):
Специфические вирусные белки предпочтительно экспрессировать в виде аутентичных вирусных белков, а не в форме гибридов. Поэтому альтернативой к описанному выше подходу служит помещение транскрипционных и трансляционных сигналов Е. coli. рядом с вирусным геном таким образом, чтобы трансляция начиналась с собственного ATG-кодона вирусного гена. Необходимыми бактериальными регуляторными элементами являются промотор транскрипции и участок связывания с рибосомой, состоящий из последовательности Шайна — Дальгарно и инициирующего кодона [106]. Для этого используют промоторы /ас-оперона [27, 106], frp-onepoHa [112], гибридный lac—^р-промотор (/ас-промотор) [9, 16], а также промотор PL фага К [8].
Участок Шайна — Дальгарно берут из прокариотического гена и помещают на различном расстоянии от вирусного инциирующе-го кодона, от чего сильно зависит уровень экспрессии [105]. Некоторые белки, например белок G вируса везикулярного стоматита [112] или малый Т-антиген SV40 [9], пагубно действуют на рост Е. coli. Поэтому в идеальной ситуация желательно их экспрессировать с помощью индуцибельного промотора. Бактерии выращивают в условиях, когда сначала экспрессию чужеродного гена подавляют, а затем .индуцируют. Промотор tac сохраняет регуляторный участок от lac-оперона я может быть индуцирован добавлением к культуральной жидкости изопропил-р-1>тиога-лактозида (IPTG). С участием этого промотора синтезирован малый Т-антиген SV40 [9]. После индукции IPTG малый Т-анти-ген накапливается в количестве, составляющем 5—10% суммарного белка Е. coli. Таким способом достигают высокого уровня экспрессии этого токсичного белка.
Цз штаммов Е. coli можно выделить функционально активные белки. Например, известно, что в клетках, зараженных SV40, малый Т-антиген SV40 разрушает цитоскелет [35]. Чтобы выяснить, действительно ли один этот белок отвечает за описанное действие, малый Т-антиген SV40 был очищен из лизатов клеток Е. coli, экспрессирующих этот белок, и затем введен в клетки путем микроинъекций. В результате наблюдали разрушение ци-тоокелета [19] и это 'свидетельствует о том, что малый Т-антиген вызывает данный эффект независимо от присутствия других вирусных белков.
Экспрессия вирусных генов в дрожжевых клетках
Экспрессия в Е. coli некоторых вирусных генов, таких как ген поверхностного антигена HBV, затруднительна. Чтобы облегчить ее, были разработаны векторы, позволяющие экспрессировать чужеродные гены в дрожжевых клетках. Поверхностный антиген HBV был экспрессирован в двух векторных системах [81, 137]. В одной из них ген, кодирующий поверхностный антиген, соединяли с промотором алкогольдегидрогеназы в дрожжевом челночном векторе [137]. Этот вектор содержит часть бактериальной плазмиды, точку начала репликации дрожжевой ДНК и дрожжевой ген trp 1 для отбора рекомбинантов. Рекомбинантные молекулы вводили в дрожжи путем трансформации и отбирали трансформанты. Полученный штамм экспрессировал негликозилированную 23К-форму поверхностного антигена. В дрожжах белок собирался в частицы размером 20 нм, похожие на частицы, обнаруживаемые в крови больных гепатитом.
Таким образом, дрожжи могут служить хорошей системой для экспрессии больших количеств белков вирусов эукариот, которые нуждаются в процессинге 'и сборке в условиях эукариотической клетки. При введении обезьянам очищенные (20 им)-частицы обеспечивали невосприимчивость к заражению вирусом гепатита [73].
Экспрессия вирусных генов в клетках млекопитающих
Хотя гены вирусов эукариот способны экспрессироваться в прокариотических клетках при соединении с 'прокариотическими регуляторными сигналами, функции продуктов вирусных генов и регуляторные сигналы можно адекватно исследовать только в нормальных клетках хозяина. Использовано несколько подходов к исследованию экспрессии вирусных генов в эукариотических клетках: введение клонированного гена обратно в геном родительского вируса, введение клонированного гена в другие вирусные геномы или использование гетерологичного вирусного генома в качестве вектора, временная экспрессия клонированного вирусного гена после прямого введения в эукариотическую клетку и стабильное включение вирусного гена в клетку хозяина.
Большая часть этих подходов представляет собой введение вирусной ДНК' непосредственно в эукариотическую клетку. Заражение путем введения молекул ДНК называется трансфекцией. Этот термин применяют также для обозначения введения субге-номных молекул вирусных ДНК (и, даже еще менее строго, для обозначения введения невирусной ДНК) в клетки. Поскольку нет системы для упаковки ДНК вирусов животных в частицы in vitro, для эффективного введения молекул ДНК в клетки разработаны специальные приемы. Наиболее распространенным и эффективным приемом для больших молекул ДНК служит осаждение ДНК фосфатом кальция [36]. Клетки поглощают преципитат и с ним ДНК проникает в клетки. В случае небольших кольцевых молекул ДНК введение в клетку можно облегчить с помощью ДЭАЭ-декстрана [74]. Для некоторых целей молекулы плазмидной ДНК можно ввести непосредственно при слиянии бактериальных клеток (несущих плазмиду) с эукариотическими клетками при помощи полиэтиленгликоля [116].
