Вирусология: В 3-х т. Том 1 - Филдс Б.Н.
ISBN 5-03-000283-9
Скачать (прямая ссылка):
ДНК-копии геномов РНК-содержащих вирусов и мРНК синтезируют при помощи обратной транскриптазы, а синтез второй цепи ДНК — при помощи ДНК-полимеразы Е. coli. Концы комплементарной ДНК (кДНК) достраивают гомополимерными «хвостами», и лигируют ее с плазмидной ДНК, также имеющей гомополимерные «хвосты» [70].
Редкие молекулы вирусной ДНК, например интегрированные с геномом хозяина или ДНК провируса ретровирусов, обычно клонируют, лигируя тотальную клеточную ДНК с ДНК фага X и затем упаковывая ДНК in vitro. Полученные вирусы подвергают скринингу при помощи гибридизации in situ с негативными колониями вируса [5]. При получении и анализе большого количества рекомбинантных молекул ДНК фаги эффективнее плаз-мидных векторов. После получения молекулы ДНК требующегося рекомбинантного фага вирусную вставку ДНК часто переносят в плазмидный вектор для дальнейшего использования.
Все шире используют векторы «а основе фага М13 [78, 79]. Простота очистки вирионов, содержащих одноцепочечную ДНК, делает их удобным источником чистой одноцепочечной ДНК для мутагенеза (см. ниже), Sl-нуклеазного анализа [84] и секвениро-ваняя ДНК по методу обрыва цепи с использованием дидезок-синуклеотидов [115].
Быстрые методы секвенирования ДНК [72, 115] позволили определить полные нуклеотидные последовательности нескольких вирусных ДНК-геномов: SV40 [21, 102], вируса полиомы [124], вируса гепатита В [22], вируса папилломы крупного рогатого скота [12], вируса папилломы человека [117], паповавируса человека [142] и вируса Эпштейна — Барр (EBV) [20]. Оеквенирова-ны клонированные ДНК-копии геномов РНК-содержащих вирусов, для которых после сопоставления получена полная последовательность генома таких вирусов, как вирус полиомиелита [58, 99] и вирус везикулярного стоматита (VSV) [23, 108, 111]. Рас-
. шифрованы клонированные ДНК ретровирусов [101, 119].
/
Экспрессия вирусных ДНК в Escherichia coli
Многие продукты вирусных генов экспрессируются в зараженных или трансформированных вирусами клетках на таком низком уровне, что их очень трудно или даже невозможно очистить для исследования функции или приготовления специфических антител. В преодолении этой трудности большую роль сыграла технология получения рекомбинантных ДНК, которая позволила повысить экспрессию некоторых участков ДНК в Е. coli.
Для экспрессии вирусных ДНК в Е. coli используют два общих подхода: 1) конструирование гибридных генов, состоящих из прокариотических генов, обычно генов р-галактозидазы (lacT.) или р-лактамазы, и генов, кодирующих последовательности вирусных ДНК, и 2) соединение вирусного гена с прокариотической регуляторной нуклеотидной последовательностью. В первом случае экспрессируется гибридный белок, а во втором образует' ся аутентичный вирусный белок.
Исходно гибридные гены, включающие нуклеотидные последовательности вирусных генов, создавали при помощи рекомбинации in vitro, используя рестрикционные эндонуклеазы, расщепляющие вирусный геном в сайтах определенных последовательностей. Образование непрерывной рамки считывания при лигировании вирусных и плазмидных последовательностей может быть предсказано. Недавно разработаны векторы для экспрессии в Е. coli, позволяющие проводить отбор и включение произвольной чужеродной ДНК, которая экспрессируется с использованием бактериальных сигналов. Они названы векторами с от-
крытой рамкой считывания (orf, от англ. open reading frame) [38]. Вектор состоит из плазмиды, которая содержит нефункциональный ген lacZ. Этот ген .инактивировали ори помощи вставки линкерного олигонуклеотида в его начальный участок, что приводит к сдвигу рамки. В линкерный участок по специфическим местам могут быть встроены произвольные фрагменты ДНК. После этого ДНК вводят в Е. coli при помощи трансформации. Включение фрагментов ДНК, имеющих непрерывную рамку считывания, может (привести к восстановлений исходной рамки считывания и дать функционально активный ген lacZ. Трансформанты 1ас+ отбирают на индикаторных средах.
В векторе orf была экспрессирована часть одного из ядерных антигенов вируса Эпштейна — Барр (EBNA) [49]. Вирус Эпштейна— Барр не удается клонировать при помощи метода бляшек, и~ поэтому классический генетический подход для него неприменим. Антиген EBNA экспрессируется в иммортализаванных вирусом лимфоцитах человека, и возможно играет важную роль в имморталязации. Однако белки EBNA трудно идентифицировать и очистить. Идентифицированы фрагменты ДНК, экспрессирующиеся в 'иммортализаванных лимфоцитах [48, 50, 132]. Один из них был введен в вектор orf, в результате чего получены /ас+-трансформанты [49]. Гибридный белок р-галактозида-за — EBNA идентифицирован по реакции с апти-р-галактозидаз-ной. и человеческой EBNA-позитивной сыворотками. Для того чтобы приготовить антисыворотку, специфичную к этому вирусному антигену, -р-галактозидазный гибридный белок очищали и вводили кроликам. Антисыворотки осаждали из лимфоцитов, трансформированных EBV, белок с мол. массой 78—85-103. Осаждаемый антиген оказался эквивалентным одному из антигенов EBNA, называемому EBNA-1. Проведенные исследования позволили установить рамку считывания для антигена EBNA-1 и получить антительную пробу на этот белок. Это свидетельствует об эффективности данного подхода три изучении сложной генетики EBV.
