Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Филдс Б.Н. -> "Вирусология: В 3-х т. Том 1 " -> 105

Вирусология: В 3-х т. Том 1 - Филдс Б.Н.

Филдс Б.Н., Найп Д.М., Мэрфи Ф.А., Харрисон С. Вирусология: В 3-х т. Том 1 — М.: Мир, 1989. — 492 c.
ISBN 5-03-000283-9
Скачать (прямая ссылка): virusologiyat11989.djvu
Предыдущая << 1 .. 99 100 101 102 103 104 < 105 > 106 107 108 109 110 111 .. 224 >> Следующая

Процедура отбора с использованием гена tk не универсальна, она наилучшим образом реализуется в клетках tk~. Найдено два доминантных селектируемых маркера, которые можно использовать на более широком спектре клеток-хозяев. Первым является ген ксантингуанин—фосфорибозилтрансферазы (gpt) Е. coli, кодирующий фермент, который позволяет эукариотическим клеткам расти в присутствии ксантина и образовывать гуанозинмонофосфат при блокировании нормального биосинте-
тического пути микофеноловой кислотой [86]. Этот фермент обычно закодирован только в прокариотических клетках Е. coli„ и поэтому его ген может быть использован в качестве селектируемого маркера в клетках эукариот всех типов. Вторым селектируемым маркером служит ген аминогликозид-фосфотрансфе-разы из транспозона Тп5 Е. coli. Этот фермент экспрессируется в эукариотических клетках, если его ген снабдить эукариотическим промотором и сигналом полиаденилирования. Его селективное фенотипическое выражение обусловлено тем, что он инактивирует антибиотик G418 и предотвращает его действие на клетки эукариот [55]. Ген этого фермента также служит доминантным селектируемым маркером.
В нескольких работах исследовали состояние фрагментов ДНК после трансформации. В результате переноса гена tk HSV из одной клетки в другую при передаче хромосом обнаружено два типа трансформантов. Трансформанты одного из них не пригодны для поддержания /&+-фенотипа; в них донорная хромосома распределялась в виде небольших кусочков по всему карио-типу. Трансформанты другого типа имели стабильный фенотип tk+ и содержали интактную донорную хромосому [59]. Трансформирующие последовательности, которые стабильно поддерживались, интегрировали с хромосомой клеток-реципиентов. В дальнейших исследованиях было показано, что последовательности, введенные совместно с геном tk HSV включаются в уникальный сайт клеточной хромосомы [107]. Гибридизацией in situ обнаружено, что в каждой клеточной линии трансформирующие фрагменты включались каждый раз в новый уникальный сайт хромосомы. Это свидетельствует о том, что включение не определяется какими-либо протяженными участками гомологии. Таким образом, эти методы введения ДНК в соматические клетки представляют собой эффективный подход для встраивания ДНК в случайные сайты клеточного генома, однако они не обеспечивают стабильного замещения предсуществующих гомологичных участков ДНК.
Мутагенез вирусных ДНК in vitro
Наиболее благотворное влияние технологии рекомбинантных ДНК на генетику вирусов связано прежде всего с тем, что с ее появлением стало возможно проводить мутагенез специфических последовательностей ДНК in vitro. Некоторые приемы мутагенеза, описанные ниже, были использованы на неклонированных фрагментах ДНК, причем эти приемы значительно облегчаются при использовании клонированных фрагментов. Другие приемы возможны только при работе с клонированными фрагментами ДНК. После мутагенеза фрагменты ДНК могут быть возвраще-
ны в инфекционный вирусный геном или введены в эукариотическую клетку, как описано выше. Критическим моментом является наличие чувствительного и надежного метода фенотипического анализа действия мутации. Различают фенотипические тесты двух основных типов. В тестах первого типа делают попытки обнаружить нуклеотидные последовательности, действующие в положении цис по отношению к экспрессии генов или репликации вирусного генома. Примерами цис-действующих элементов служат промоторы транскрипции и энхансеры, а также участки начала репликации. Фенотипические тесты второго типа проводят с целью определить функцию специфических кодирующих последовательностей путем их изменения. В этом случае необходимо разработать метод фенотипического анализа функции соответствующего генного продукта.
Введение делеционных мутаций
Введение делеций в вирусные геномы широко использовали в генетике вирусов еще до получения клонированных вирусных геномов. Делеционные мутанты SV40 получали линеаризацией ДНК по определенным или случайным сайтам с последующей трансфекцией клеток. Нуклеазы в клетках отщепляли концы молекулы до циклизации и начала репликации. Жизнеспособные делеционные мутанты отбирались сами [76], а нежизнеспособные поддерживались благодаря их комплементации с температурочувствительными мутантами [61, 77]. Появление клонированных молекул ДНК SV40 позволило вводить в них делеции и нарабатывать эти молекулы в Е. coli независимо от жизнеспособности вируса. После этого вставку вирусной ДНК можно вырезать из рекомбинантной-плазмиды, лигировать с идентичными или другими фрагментами ДНК вируса и трансфицировать ими клетки для того, чтобы проверить жизнеспособность мутантного вируса [92].
Делеции использовали для тестирования функций специфических кодирующих участков ДНК. Серия мутантов с делеция-ми в ранней области SV40 кодирует укороченные в разной степени молекулы большого Т-антигена [95, 96]. Свойства мутантных белков исследовали с целью локализации определенных участков молекулы белка, ответственных за различные функции Т-антигена [14, 126]. Пользуясь аналогичным подходом, удалось показать, что С-конец гликопротеина VSV служит мембранным якорем [110]. В дальнейшем выяснили, что структура цитоплазматического домена этого белка влияет на созревание в процессе его перемещения на поверхность клетки [109].
Предыдущая << 1 .. 99 100 101 102 103 104 < 105 > 106 107 108 109 110 111 .. 224 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed