Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Филдс Б.Н. -> "Вирусология: В 3-х т. Том 1 " -> 103

Вирусология: В 3-х т. Том 1 - Филдс Б.Н.

Филдс Б.Н., Найп Д.М., Мэрфи Ф.А., Харрисон С. Вирусология: В 3-х т. Том 1 — М.: Мир, 1989. — 492 c.
ISBN 5-03-000283-9
Скачать (прямая ссылка): virusologiyat11989.djvu
Предыдущая << 1 .. 97 98 99 100 101 102 < 103 > 104 105 106 107 108 109 .. 224 >> Следующая

Геномы вирусов папилломы относятся к экспрессирующим векторам другого типа. В клетках, трансформированных вирусом папилломы крупного рогатого скота (BPV), геном вируса находится в виде эписомной сверхспиральной кольцевой молекулы ДНК [63, 68, 82]. Последовательности ДНК-вставки реплицируются как часть молекулы ДНК BPV. Такой вектор имеет несколько преимуществ. Во-первых, геном BPV вызывает онко-генную трансформацию клеток, что можно использовать как признак для фенотипической селекции. Во-вторых, молекулы не интегрируют, так что уровни экспрессии исследуемого гена не зависят от фланкирующих последовательностей. В-третьих, молекулы ДНК кольцевые, поэтому были созданы векторы, которые могут при трансформации посредством ДНК прямо переноситься из Е. coli в клетки млекопитающих и наоборот [17]. Длинный концевой повтор (LTR) вируса опухолей молочных желез мыши (MMTV) был встроен 'в вектор на основе BPV [89]. В результате получены различные трансформированные линии клеток. Показано, что рекомбинантные молекулы остаются неинтегрированными и не подвергаются перестройкам, однако тем не менее уровни экспрессии мРНК с различных промоторов MMTV в LTR сильно варьировали в различных линиях клеток. Транскрипция с промоторов MMTV может быть усилена обработкой глюко-кортикоидным гормоном. Степень вызываемой ими индукции
также варьировала в различных клеточных линиях. Эти олыты показали, что на уровень экспрессии влияет не только 'непосредственное окружение ДНК в клеточном геноме.
На основе генома HSV сконструированы субгеномные реп-ликоны [127, 130]. Большой размер генома USV, а также данные о том, что о-н может нести вставку по крайней мере 8 тысяч пар оснований (kb) [60], позволяют предполагать, что он способен служить в качестве вектора. Однако экспрессии вставленного клеточного гена с собственного промотора не наблюдается (N. Frenkel, личное сообщение). Это, вероятно, связано с тем, что HSV подавляет транскрипцию и (или) трансляцию клеточных РНК. Для того чтобы HSV мог служить экспрессирующим вектором, вероятно, нужно, чтобы вставленные гены использовали промоторы и трансляционные сигналы вируса, либо необходимо создать варианты HSV, которые не подавляют экспрессии клеточных генов.
Подобно HSV поксвирусы содержат большой ДНК-геном, но в отличие от них имеют более сложный репликативный цикл. Поскольку поксвирусы используют для транскрипции ДНК в цитоплазме свой собственный аппарат, неудивительно, что встроенные в их геном чужеродные гены экспрессируются на низком уровне, если вообще экспрессируются. Однако, когда перед б'-концом встроенного гена вставляли транскрипционный сигнал ‘вируса осповакцины, наблюдалась экспрессия чужеродного гена. Рекомбинанты создавали в два этапа. Чужеродный ген встраивали при рекомбинации in vitro таким образом, что ген оказывался расположенным после промотора вируса осповакцины. Рекомбинантными ДНК трансфицировали клетки после заражения вирусом осповакцины. Гибридные молекулы включались в вирус путем рекомбинации in vivo [88, 140]. Есть сообщения об экспрессии поверхностных антигенов HBV [91, 122], гемагглютинина вируса гриппа [90, 123] ,и гликопротеина D HSV [91]. Более того, рекомбинанты индуцируют иммунный ответ, ограничивающий репликацию соответственно вирусов гепатита В, гриппа и HSV. Поскольку эти рекомбинанты представляют собой живые вакцины в том смысле, что вирусные антигены экспрессируются на поверхности клеток хозяина, антивирусный иммунитет к ним, вероятно, обеспечен как гуморальным, так и клеточным механизмами. Таким образом, гибридные вирусы служат прекрасными кандидатами для антивирусной терапии,'поскольку об эффектах вакцинации вирусом осповакцины известно очень много; и что особенно важно, при этом можно обходиться без более рискованного применения других аттенуированных вирусов.
Для использования в качестве векторов сконструированы также варианты геномов ретровирусов. В рекомбинантные мо-
лекулы ДНК различных провирусов был встроен ген тимидин-киназы HSV [118, 134, 139]. Этими ДНК трансфицировали клетки с фенотипом tk~, после чего отбирали трансформанты. Инфекционный вирус, содержащий tk-reн, может быть получен при суперинфекции вирусом-помощником, или при совместной трансфекции с полноразмерной вирусной ДНК. Включение tk-гена приводит к повреждению части репликативных функций, поэтому для восполнения этих функций требуется вирус-помощник.
Необходимость ретровирусного генома-помощника может быть снята при использовании клеточной линии, которая предоставляет все функции для репликации и упаковки ретровирусов, но не дает инфекционного вируса [71]. Сконструированы мутантные ретровирусы, которые утратили последовательности РНК, необходимые для упаковки, включения РНК в капсид и одевания в оболочку. При заражении клеток провирус включается в клеточный геном, после чего синтезируются вирусные РНК и белки. Эти клетки представляют собой идеальную систему для размножения рекомбинантных, дефектных по репликации геномов. Трансфекция этих клеток дефектными геномами приводит к образованию вирионов, содержащих преимущественно рекомбинантные геномы [71]. Такие вирионы потенциально свободны от цитолитичеоких и трансформирующих функций и очень удобны в качестве векторных систем.
Предыдущая << 1 .. 97 98 99 100 101 102 < 103 > 104 105 106 107 108 109 .. 224 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed