Вирусология: В 3-х т. Том 1 - Филдс Б.Н.
ISBN 5-03-000283-9
Скачать (прямая ссылка):
Делеционный анализ использовали также для выявления участков ДНК, регулирующих экспрессию ранней области транс-
крипции SV40. В область перед точкой начала ранней транскрипции были введены различные делеции. Делеция области, названной последовательностью ТАТА, расположенной примерно за 30 пар оснований от точки начала транскрипции, изменяет положение этой точки при введении гена в клетки [4, 26]. Следовательно, эта последовательность требуется для правильного выбора 5'-конца мРНК- Делеция последовательностей перед ТАТА полностью снимает экспрессию ранних генов [4]. В этой области расположен регуляторный участок, состоящий из 72 пар оснований и представленный дважды повторяющейся последовательностью за 100—175 пар оснований до начала транскрипции. Делеция, выходящая за пределы одного повтора, подавляет транскрипцию {42]. Впоследствии было показано, что этот участок из 72 пар оснований является общим энхансером экспрессии генов, поскольку он усиливает экспрессию и других генов, помещенных перед или за ним {2], причем его действие не зависит от его положения по отношению к генам, экспрессию которых он усиливает.
Делеция сближает соседние участки- ДНК. Возникшая, близость последовательностей потенциально может иметь таксой же сильный эффект, как и сама делеция. Для того что^ы этого избежать, был разработан уникальный набор мутаций. При исследовании транскрипционных сигналов перед геном тимидинкина-зы HSV Мак-Найт и Кингсбери {75] создали делеционные мутанты по последовательностям, предшествующим гену tk. На место делеции они ввели линкерную последовательность Ват HI длиной 10 пар оснований. Мутанты, у которых концы делеции были разделены десятью парами оснований, рекомбинировали in vitro путем лигирования по Ват HI-сайту. Это привело к изменению последовательности таким образом, что 10 пар оснований оказались замененными на линкерную последовательность. Относительные расстояния были сохранены такими же, как и в неделетированной последовательности. Создана целая серия таких мутантов, названных мутантами с подвижным линкером. Рекомбинантные плазмиды вводили в ooufiTbl' Xenopus laevis и определяли уровень экспрессии РНК. Для транскрипции важны три участка: последовательность ТАТА за 16—32 нуклеотида до точки начала транскрипции, богатая гуанозином последовательность на расстоянии 47—61 нуклеотид перед ней и последовательность за 97—105 нуклеотидов до начала гена tk. Этот подход позволил провести детальный анализ и определение трех различных регуляторных сигналов перед геном tk.
Путем модификации описанной выше процедуры делеции были введены в геном аденовируса. Делецию можно ввести в клонированный фрагмент ДНК аденовируса. Его выщепляют из плазмиды и лигируют с другим фрагментом ДНК аденовируса
с образованием инфекционного генома. Таким способом обнаружили, что для эффективного роста аденовируса необходима малая РНК VAI. Кроме того, показано, что эта РНК усиливает ^трансляцию поздних вирусных мРНК- Эти работы подтвердили, что малая РНК VAI является составной частью механизма,, регулирующего трансляцию вирусных мРНК.
Введение точечных мутаций
В этом разделе мы обсудим различные подходы, используемые для введения точечных мутаций в вирусные ДНК in vitro и приведем соответствующие примеры. Одним из наиболее простых подходов к локальному мутагенезу является химическая модификация фрагментов ДНК in vitro с последующей трансфекцией мутированных фрагментов ДНК совместно с инфекционным геномом дикого типа [13, 113]. Мутированные участки включают в инфекционный вирус путем рекомбинации in vivo. Дочернее потомство отбирают по определенному фенотипу, например по температурочувствительности. При таком подходе мутагенез ограничен определенными участками генома. Его применяли для мутирования участка генома HSV, кодирующего основной ДНК-связывающий белок, называемый ICP8. Путем мутагенеза фрагмента ДНК in vitro гидроксиламином с последующей рекомбинацией in vivo с геномом дикого типа был создан температурочувствительный мутант teHAl. Мутация картируется в последовательности, кодирующей ICP8 (или рядом с ней) [15]. В последующих экспериментах по комплементации было показано, что этот мутант аналогичен большой группе мутантов, выделенных ранее [141]. Идентификация мутаций по этому гену позволила проводить генетический анализ функций ДНК-связывающего белка HSV [30, 65].
Для введения точечных мутаций в кольцевые геномы папо-вавирусов разработаны более тонкие приемы. Первый прием сайт-специфического мутагенеза включает отбор' мутантов с утраченными участками расщепления рестрикционными эндонуклеазами [121]. ДНК SV40 расщепляли рестрикционной эндонуклеазой в присутствии бромистого этидия. В этих условиях фермент делал разрывы только в одной цепи ДНК. Концы разорванных цепей отщепляли экзонуклеазой, что приводило к образованию коротких одноцепочечных пробелов. Одноцепочечные ДНК обрабатывали мутагенными реагентами, специфичными к одноцепочечной ДНК, такими как ион бисульфита. Затем пробел застраивали и отбирали геномы, утратившие сайты рестрикции. Эту процедуру применяли для получения мутантов по сайту расщепления Bgll в геноме SV40 [120]. Такой способ мутагенеза дал несколько мутантов по точке начала репликации ДНК. Ско-
