Вирусология: В 3-х т. Том 1 - Филдс Б.Н.
ISBN 5-03-000283-9
Скачать (прямая ссылка):
рость и уровень репликации мутантных геномов отличались по сравнению с диким типом. Измененный фенотип не восстанавливался при совместном заражении с вирусом дикого типа. Таким образом, в этих исследованиях удалось выявить последовательности ДНК, контролирующие ее репликацию в положении цис.
Второй прием сайт-специфической индукции точечных мутаций, не применявшийся сколько-нибудь широко для вирусных геномов, включает образование одноцепочечных петель вытеснения ДНК (D-петель). Отжиг небольшого рестрикционного фрагмента с кольцевой молекулой ДНК ведет к гибридизации данного фрагмента и вытеснению одной цепи. Это вытеснение облегчается белком recA Е. coli. Далее можно провести химическую модификацию экспонированной одноцепочечной последовательности. Это позволяет избирательно мутировать любой участок, из которого получен фрагмент ДНК.
Третий метод сайт-специфического мутагенеза включает использование синтетического олигонуклеотида, содержащего требующуюся мутацию. Этот олигонуклеотид отжигают с одноцепочечной ДНК и полученным гибридом. трансфицируют клетку. Произвольная репарация неспаренных оснований ведет к закреплению мутации в инфекционном геноме. Так, например, в ходе получения мутаций [11] синтетический олигонуклеотид гибриди-зовали с цепью ДНК вируса полиомы, клонированной в фаге М13. Этой ДНК трансфицировали Е. coli и идентифицировали клоны М13, которые содержали мутированные последовательности. Репликативную форму ДНК одного из этих клонов М13 расщепляли и лигировали с фрагментами вирусной ДНК для образования инфекционного вирусного генома. Полученный мутантный геном содержал терминирующий кодон типа ochre в рамке, кодирующей средний Т-антиген, и кодон валина вместо кодона аланина в перекрывающейся рамке, детерминирующей малый Т-антиген. Таким образом, этот подход позволил исследователям укоротить белок в одной из двух рамок считывания. Мутантный средний Т-антиген утратил 37 аминокислот на С-кон-це и стал дефектным по прикреплению к мембранам и протеин-киназной активности, а мутантный вирус дефектен по трансформации клеток. Эти результаты четко свидетельствуют о роли среднего Т-антигена в опухолевой трансформации клеток вирусом полиомы.
Включение последовательностей вирусных ДНК в новые сайты вирусного генома
Еще одной формой мутации вирусного генома является его перестройка или включение фрагментов вирусных ДНК в новые сайты генома. Хотя последовательности вирусных ДНК иногда включа-
ются в новые сайты спонтанно, эти случаи относительно редки и поэтому геномные перестройки необходимо либо отбирать, либа конструировать. Для исследования удобен ген tk HSV, поскольку существует процедура отбора вирусов tk+ и tkr. Ген tk с мутацией был введен в геном HSV, после чего туда был встроен функционально активный ген tk, слитый с регуляторной областью одного из альфа-генов (предранних). Это привело к превращению гена tk из раннего в предранний; следовательно, области перед геном определяют период экспрессии в ходе инфекции.
Одним из наиболее впечатляющих примеров вирусного генома, содержащего реорганизованные последовательности, является мутант SV40, геном которого содержит транспозицию между ранней и поздней областями [64]. В этом геноме область, содержащая точку начала репликации, и область, содержащая ранний и поздний сигналы транскрипции, были инвертированы. В результате ген Т-антигена оказался возле позднего промотора, а поздняя область рядом с ранним промотором. Этот геном-экспрессирует Т-антиген с позднего промотора и при заражении содержащим его мутантом происходит повышенная наработка Т-антигена. При этом Т-антиген, вероятно, не осуществляет негативную регуляцию своего синтеза, как это происходит в случаенормального генома; вместо этого он может усиливать поздний промотор и свою собственную экспрессию. Данная работа показала, что поздний промотор может использоваться без предварительной экспрессии раннего гена. Этот мутантный вирус дает уникальную возможность исследования позднего промотора SV40.
Селекция вирусных мутантов с изменениями в определенных белках —
Для отбора и идентификации вирусных мутантов, которые имеют изменения в определенных белках, был использован дополнительный генетический подход. Этот подход включает отбор вирусов, которые кодируют белки, не узнаваемые моноклональными антителами, специфичными к белку дикого типа. Наиболее прост отбор вирусов, которые нельзя нейтрализовать моноклональными антителами, специфичными к одному из поверхностных белков вириона [24]. Отбираемые вирусы содержат антигенно измененные поверхностные белки. Таким способом проведен широкий анализ гемагглютинина вируса гриппа. Были секвенированы гены гемагглютинина мутантных вирусов и установлено положение мутаций. После этого удалось определить положение измененных аминокислот в кристаллической структуре молекулы гемагглютинина. В результате были картированы основные антигенные детерминанты в трехмерной структуре этого белка. Детальное описание этой работы приведено в гл. 4.
Мутации этих антигенных вариантов или мутантных штаммов обычно не влияют явным образом на вирусную репликацию. Для картирования мутаций, резистентных к моноклональным антителам (таг, от англ. monoclonal antibody-resistant) у HSV, разработана следующая новая методика [52]. Антитела, узнающие поверхностные антигены, связываются с клетками. Вторые антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена, связываются с первыми. Пероксидаза катализирует реакцию с субстратом 4-хлор-1-нафтолом, приводя к образованию темного осадка на клетках, с которыми связаны антитела. Все бляшки, полученные от вирусов, кодирующих белок, узнаваемый антителами, становятся черными в то время, как мутантные бляшки бесцветные. После трансфекции клеток мутантным геномом совместно с различными фрагментами ДНК дикого типа дочерние вирусы тестировали на способность образовывать черные бляшки. Черные бляшки наблюдали в тех случаях, когда происходила рекомбинация с образованием дикого типа. С помощью описанной модифицированной методики спасения маркера удалось картировать мутации.
