Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Клонирование гибридом методом предельных разведений. Содержимое лунок, показавших положительный результат при тестировании, изучают под микроскопом и оценивают, содержат ли они одну или большее число гибридом. Клетки разводят до концентрации 3 клетки/мл и распределяют по 0,2 мл в 96-луночные микроплаты, в которых содержится 5-104 филерных клеток (макрофагов или тимоцитов) на лунку. Отдельные клоны клеток, выросшие в лунках через 10 дней, тестируют методами иммуноферментного анализа, как описано выше.
Наращивание гибридом. Клоны, которые оказались положительными, наращивают, пока они не займут 2/з поверхности 96-луночной платы. После этого их переносят в лунки 24-луночных плат, содержащих по 1 мл ростовой среды. Через несколько дней клетки из нескольких лунок этих плат объединяют и переносят в 50 мл флаконы для культивирования. Оптимальная для роста плотность клеток — 500 тыс. на 1 мл. После этого клетки могут быть помещены в сосуды для культивирования объемом 250 мл и более.
Наращивание гибридом в виде асцитов. Мышам линии Balb/c
2—3-месячного возраста внутрибрюшинно вводят 0,5 мл пристана (2, 6, 10, 14-тетраметилпентадекана). Через 7 дней мышам вводят 106—107 клонированных гибридомных клеток в 0,5 мл ДМЕМ-рос-товой среды. Клетки должны находиться в экспериментальной фазе роста. На 14—21-й день отбирают 4—5 мл асцитной жидкости.
Замораживание гибридомных клеток. Замораживание необходи-
мо осуществлять на всех стадиях получения гибридом. Скорость снижения температуры 1° в 1 мин. В специальные стерильные ампулы для замораживания, охлажденные до 0°С, помещают 107 клеток, суспензированных в фетальной сыворотке, содержащей 5% диметил-сульфоксида. Ампулы помещают на ночь в холодильник (—70°С). На следующий день ампулы переносят в жидкий азот.
Размораживание клеток проводят быстро, помещая пробирки в водяную баню с /=37°С. Размороженные клетки разводят 10 мл гиб-ридомной среды и осаждают центрифугированием. Осадок ресус-пензируют в ростовой гибридомной среде до плотности 4 - 10s клеток/мл и помещают по 0,2 мл в 96-луночные микроплаты. Только что размороженные клетки хорошо растут при концентрации сыворотки в среде 20%. После того как начался рост, концентрацию сыворотки уменьшают до 5—10%.
Хранение моноклональных антител. Моноклональные антитела могут быть сохранены в виде лиофильно высушенной культуральной жидкости, однако при этом часто происходит потеря иммунологической активности. Культуральная надосадочная жидкость хорошо хранится в течение 1 г при 4°С в присутствии 0,1% азида натрия. Она может быть сохранена неопределенно долго при замораживании (^=70°С); при этом необходимо избегать повторного замораживания и оттаивания.
Асцитная жидкость полностью стабильна при хранении в стерильном состоянии при 4°С. В течение долгого времени моноклональные антитела могут храниться при 4°С в 50%-ном сульфате аммония.
§ 2. Использование моноклональных антител в иммуноанализе
Основным достоинством моноклональных антител является возможность их получения в неограниченных количествах с идентичными от партии к партии физико-химическими характеристиками. Это позволяет создавать на их основе стандартные диагностические реагенты.
Хотя сам процесс получения гибридом достаточно трудоемок и дорог, тем не менее, после того как гибридома получена, крупномасштабное производство моноклональных антител стоит довольно дешево и все затраты на получение гибридом себя оправдывают. В качестве недостатка моноклональных антител часто указывают на нестабильность гибридом и возможную потерю ими продукции. Однако большинство гибридом достаточно стабильно, если их ре-клонировать 1—2 раза в год.
# Большим преимуществом использования гибридом является то, что в процессе клонирования и отбора исследователь может выбрать гибридомы с желательными для него свойствами в отношении специфичности взаимодействия, констант аффинности, физико-хими-
ческих свойств, влияющих на возможности их использования в анализе. Получить поликлональные антитела с нужными свойствами из сыворотки животных значительно труднее.
Все моноклональные антитела имеют одинаковую специфичность, одинаковы по аффинности, относятся к одному классу и подклассу. Поскольку моноклональные антитела являются нормальным компонентом иммунного ответа организма, то ойи могут распознавать общие эпитопы на разных антигенах или полиморфные формы одного и того же эпитопа. Однако моноклональные антитела могут распознавать только одну из полиморфных форм эпитопа и могут не распознавать другие полиморфные формы молекулы антигена.
В очень редких случаях может наблюдаться перекрестная реактивность моноклональных антител по отношению к неродственным антигенам. Это связано со сходным пространственным распределением зарядов, полярности и гидрофобности на отдельных участках таких молекул. Подобная ситуация реализуется, например, при взаимодействии эндорфинов и алкалоидов с одними и теми же клеточными рецепторами. Однако по отношению к моноклональным антителам перекрестная реактивность подобного рода наблюдается крайне редко. Размеры структур, распознаваемых моноклональными антителами, меньше, и распознаются они точнее, чем структуры, распознаваемые смесью поликлональных антител. Учитывая то, что антигенсвязывающий центр антител имеет полицентровую структуру, необходимо помнить, что направленность моноклональных антител к одному эпитопу и высокая специфичность не исключает возможности их перекрестной реактивности с эпитопами схожей химической структуры, хотя при этом обычно наблюдается различие констант связывания.
