Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
1. (г)— соон + с6нпы=с=мс6ни-------^ (?)—COO—CNHC6H„ ——
C6H„N
НО—N
СО—СН,
( I
Уо—сн2
(г)—COO—N
уСО—сн2 \о—Сн
2.
,со—сн2
(г)—COO—l/' |
V-
'СО—сн
+ NH —(б)—(?)—СО—NH—(б) +
СО—СН,
+ но-
¦< I
'Г*/Л Г
СО—сн.
Синтез конъюгата простагландина Е% — БСА.
К раствору 100 мг простагландина Ег в 1 мл диметилформамида добавляют 60 мг дициклогексилкарбодиимида и 70 мг N-оксисукцинимида. Смесь перемешивают при комнатной температуре 30 мии, отфильтровывают выпавший осадок замещеииой мочевины и фильтрат добавляют к раствору 250 мг БСА и 10 мл 0,1М гидрокарбоиата натрия. Реакционную смесь инкубируют при 4°С и течение 2 ч, диализуют протии 0,05 М фосфатного буфера, pH 8,0, и храият при —20 °С. С каждой молекулой БСА связывается 15 молекул гаптена.
. Получение конъюгатов-носителей с гаптенами, содержащими аминогруппу. Гаптены с доступной для модификации аминогруппой можно разделить на две группы по способам их конъюгирова-
ния с носителями. К первой группе относятся ароматические амины. Аминогруппа этих соединений превращается в диазониевую соль под действием нитрита натрия и серной кислоты, а затем вступает в реакцию с белками при pH 9:
ф~Ш2 -ар.» (fbNSN (?)—N=N—(Б)
Реакция протекает по гистидиновому, тирозиновому или трипто-фановому остаткам белка-носителя. Для гаптенов, содержащих ароматические нитрогруппы, например хлорамфеникол, используют этот же метод получения конъюгатов, причем в данном случае нитрогруппу гаптена предварительно восстанавливают до аминогруппы.
Ко второй группе относятся гаптены, содержащие алифатические аминогруппы. Их конъюгаты получают с помощью водорастворимых карбодиимидов. С помощью другого способа такие амины превращают в я-нитробензоиламиды, которые затем восстанавливают до производного, содержащего ароматическую аминогруппу, и конъюгируют с белком через диазониевую соль:
Гаптены с алифатическими ЫН2-группами могут быть также конъюгированы с е-аминогруппами белков-носителей через гомоби-функциональные реагенты, такие, как глутаровый диальдегид или толуол-2,4-диизоцианат.
Получение конъюгатов-носителей с гаптеиами, содержащими гидроксильную или карбонильную группу. К гаптенам этого класса относятся различные спирты, фенолы, кетоны, сахара, полисахариды, нуклеозиды, а также такие биологически важные соединения, как стероиды. Обычно эти соединения не используют непосредственно для получения конъюгатов, а превращают их в какие-либо производные, содержащие СООН-группу, которые затем конъюгируют с белками, уже описанными способами.
Соединения, включающие ОН-группу, такие, например, как стероиды, обычно превращают в производные с СООН-группой с помощью реакций:
1) этерификациис ангидридами дикарбоновых кислот (например, янтарный ангидрид или малеиновый ангидрид):
где R = —СН2—СН2— (гемисукцииат) или —СН=СН— (гемималеат)
2) карбоксиметилирования с бром- или иодуксусной кислотой:
3) взаимодействия с фосгеном с образованием хлоркарбонатов:
Синтез гемисущината 11а-оксипрогестерона.
Растворяют в минимальном объеме пиридина 1 la-оксипрогестерон, добавляют 5-кратный избыток янтарного ангидрида и кипятят в колбе с обратным холодильником 20 ч. Раствор выливают в холодную воду и экстрагируют эфиром. После промывки эфирных вытяжек водой продукт экстрагируют раствором гидрокарбоната и осаждают 10%-ным раствором НС1. Вещество переосаждают из CH2CI2 гексаиом.
Альдегиды и кетоиы, а также стероиды, содержащие СО-группу, модифицируют с помощью 0-(карбоксиметил)гидроксиламина (другие названия этого соединения— карбоксиметоксиамин или аминооксиуксусная кислота). В результате реакции получаются так называемые карбоксиметилоксимы, содержащие СООН-группу, по которой проводят пришивку гаптена к белку-иосителю:
гидрохлорида растворяют в смеси 60 мл 20%-ного метанола и 40 мл 1 М натрий-ацетат буфера. Инкубируют реакционную смесь в течение ночи при комнатной Температуре и упаривают до 20 мл. Доводят pH раствора до 8,5 с помощью 2 н. NaOH и. раствор экстрагируют 4 раза по 200 мл этилацетатом. Объединенные органические вытяжки промывают 2 раза по 300 мл 0,1 и. NaOH и 2 раза по 500 мл воды. Собирают все водные вытяжки, подкисляют их раствором НС1 до pH 3,0 и экстрагируют 4 раза по 500 мл этилацетатом. Из Этих органических Вытяжек отгоняют растворитель и вещество перекристаллизовывают из ацетона,
В соединении с фенольными ОН-группами, такими, например, как резерпин, Д7-тетрагидроканнабинол, 17р-эстрадиол и др., кар-
©-он + хсн^соон —— 0-о—сн2соон
X = Br, I
0—ОН + СОС12 —*- 0—о—СО—-С1
R
R
Синтез 6-О-карбоксиметилоксима 17р-эстрадиола.
Смесь 0,5 г 6-кето-17р-эстрадиола и 0,5 г 0-(карбоксиметнл)гидроксиламнн-
боксильная группа может вводиться через диазотированную п-ами-нофенилуксусную кислоту:
