Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Наиболее простым и чувствительным способом выявления антител, способных одновременно связываться с антигеном, является тест на аддитивность связывания. Предварительная очистка и введение метки в моноклональные тела в этом случае не нужны. В основе метода лежит оценка числа антигенных центров, одновременно доступных для пары антител. Определение осуществляется методом непрямого твердофазного иммуноферментногб анализа. Основным условием при этом является полное насыщение антигена обоими типами антител. Поэтому на первой стадии эксперимента необходимо получить кривые насыщения антигена айцитной или культуральной жидкостью, содержащей анализируемые антитела, и затем определить максимальную оптическую плотность в иммунофермент-ном тесте, достигаемую при насыщении.
Для того чтобы проверить, действительно ли антиген насыщен антителами и выход кривой титрования на плато достигается не за счет низких концентраций иммуноферментного конъюгата, эксперимент повторяют с удвоенной концентрацией последнего. Если оптическая плотность при этом существенно не изменяется по сравнению с предыдущим экспериментом, считают, что насыщение достигнуто.
Затем в каждую лунку покрытого антигеном планшета для микротитрования добавляют растворы, содержащие количества моноклональных антител, определённые в предыдущих экспериментах. Если оптическая плотность, полученная при инкубации антигена с парой антител, близка к сумме оптических плотностей, полученной для каждого моноклонального антитела в отдельности при насыщении, то это означает, что два антитела связываются с антигеном одновременно. Если же оптическая плотность близка, к достигаемой, каждым раствором антитела по отдельности, то они конкурируют за связывание с одним и тем же центром на антигене. Количественно полученные результаты выражают с помощью им-
декск, аддитивности (ИА):
At + Аг
А1+2 п
ИА =-------------------------100 о/0, (6.1)
А, + Аг (Ai 4- Аг) — -
где А\, Ач и Ai+2 — оптическая плотность, измеряемая в непрямом твердофазном иммуноферментном тесте с первым антителом в отдельности, вторым антителом в отдельности и двумя антителами вместе.
Если два антитела связываются с одним и тем же центром, то Ai+2= (Ai + A2)/2, и ИА=0. Если же два антитела связываются независимо с различными участками, A)+2=(Ai + A2) и индекс аддитивности должен быть равен 100%.
Отбор моноклональных антител по константам связывания с антигеном. Для количественного определения антигенов, содержащихся в биологических жидкостях в низких концентрациях, необходимо иметь моноклональные антитела с высокими константами аффинности. При этом для отбора соответствующих' гибридом на сравнительно ранних стадиях их получения важно, чтобы применяемые методы определения констант не зависели от больших количеств антител. Достаточно удобным для этих целей является ранее описанный выше метод Фрикста.
7
Методы получения конъюгатов
для иммуноферментного анализа
В ИФА используются конъюгаты антигенов (гаптенов) и антител с различными белками, синтетическими полимерами, ферментами и их субстратами и кофакторами.
• Отметим основные задачи ИФА, связанные с необходимостью синтеза конъюгатов:
1) получение специфических антисывороток к низкомолекулярным соединениям— гаптенам;
2) получение меченных ферментом или субстратом антигенов (гаптенов) и антител;
3) получение иммобилизованных на твердой фазе гаптенов через конъюгат гап-тен-носитель (белок, полимер).
Разработка высокочувствительных и специфических методов ИФА связана с необходимостью получения конъюгатов, обладающих определенными характеристиками.
О В этой связи можно сформулировать основные требования, которым должны удовлетворять методы синтеза различного рода конъюгатов:
1) должны сохраняться ферментативные, иммунологические или антигенные свойства конъюгата;
2) конъюгат должен легко выделяться из реакционной смеси при использовании соответствующих методов очистки;
3) выход конъюгата должен быть достаточно высоким;
4) конъюгат должен быть определенного состава;
5) полученный конъюгат должен быть стабильным при хранении.
\ § 1. Синтез конъюгатов гаптенов
с носителями для получения антител
Для того чтобы гаптен обладал иммуноген-ными свойствами, необходимо получить конъюгат гаптена с высокомолекулярным носителем. В качестве носителей обычно используют бычий сывороточный альбумин (БСА), альбумин сыворотки человека, овальбумин, тироглобулин и синтетические пептиды типа полилизина. Особых преимуществ у какого-либо носителя не отмечено и поэтому чаще всего им является наиболее доступный белок — БСА. Для хороших иммуногенных свойств конъюгата важно число молекул гаптена, конъюгированных с носителем. Показано, что слишком малое и слишком большое количество молекул гаптена, пришитых к носителю, ухудшает иммуногенные свойства. Для конъюгирования с БСА, по-видимому, наиболее оптимально вводить 10—20 молекул гаптена на молекулу носителя.
