Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Егоров А.М. -> "Теория и практика иммуноферментного анализа" -> 72

Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.

Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилов Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа — М.: Высшая школа, 1991. — 288 c.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка): teoriyaipraktika1999.djvu
Предыдущая << 1 .. 66 67 68 69 70 71 < 72 > 73 74 75 76 77 78 .. 123 >> Следующая

Наиболее простым способом оценки специфичности моноклональных антител в процессе клонирования гибридом является метод непрямого твердофазного иммуноферментного анализа с применением TSP-планшетов. TSP-планшеты представляют собой полисти-рольные стерильные крышки к 96-луночным культуральным платам, имеющие выступы, опускающиеся в лунки. Поверхность выступов TSP-планшетов может быть покрыта в стерильных условиях антигеном. Планшетом накрывают плату, в которой выращивают гибри-домы таким образом, чтобы покрытые антигеном выступы опустились в среду культивирования гибридом. Выдерживают 1 ч и заменяют на новый планшет, выступы которого покрыты перекрестно реагирующим антигеном. Дальнейшую обработку TSP-крышек проводят в соответствии со стандартной методикой для непрямого твердофазного иммуноферментного анализа. Используя этот метод, можно в течение одного дня провести оценку способности моноклональных антител взаимодействовать с перекрестно реагирующими антигенами. Это дает возможность уже через 12—15 дней отобрать и клонировать только те гибридомы, которые обладают нужной исследователю специфичностью.
Количественная оценка степени перекрестной реактивности антигенов. В ряде случаев трудно бывает достичь абсолютной специфичности взаимодействия моноклональных антител с антигеном, но такие антитела, тем не менее, могут быть использованы в иммуноанализе при условии, что концентрация перекрестно реагирующих антигенов в анализируемых образцах невелика.
Д^я некоторых целей бывает необходимо получить моноклональные антитела с максимально широким спектром перекрестной реактивности. Количественная характеристика перекрестной реактивности определяется по степени ингибирования связывания моноклональных антител с иммобилизованным агентом в присутствии растворимого перекрестно реагирующего антигена. Степень перекрестной реактивности исследуемых антигенов характеризуют индексом «/50», представляющим собой концентрацию конкурирующего антигена, которая достаточна для ингибирования на 50% процесса связывания фиксированного количества моноклональных антител с иммобилизованным антигеном, использованным для получения моноклональных антител.
Полуколичественная оценка /50 на ранних стадиях культивирования гибридом может быть осуществлена методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа. В лунки платы для миКро-титрования, покрытые антигеном, использованным для получения моноклональных антител, помещают по 25 мкл растворенного в фосфатно-солевом буфере с тритоном перекрестно реагирующего антитела, концентрацию которого варьируют от 1 • 10~6 до 1 • 10-10 М. Затем в каждую лунку добавляют 25 мкл среды культивирования гибридом, разведенной в 2 раза буфером, содержащей моноклональные антитела. Аналогичным образом параллельно титруют исходный антиген, к которому были получены моноклональные антитела. В качестве контроля титрование сходного и перекрестно реагирующего антигенов осуществляют в присутствии 25 мкл разведенной в 2 раза среды культивирования гибридом, не содержащей моноклональных антител. Контрольные и опытные образцы инкубируют 1 ч при 37°С, а затем обрабатывают планшеты по методике для проведения непрямого твердофазного иммуноферментного анализа.
• Оценивая значение оптического поглощения раствора субстрата после внесения его в лунки микроплаты, выявляют те концентрации конкурирующих антигенов, которые ингибируют на 50% связывание моноклональных антител с иммобилизованным на полистироле антигеном. Степень перекрестной реактивности оценивают отношением /5о перекрестно реагирующего антигена к До исходного: чем оно больше, тем меньше степень перекрестной реактивности.
Отбор моноклональных антител, связывающихся с различными эпитопами на антигене. Для высокоспецифического выявления ряда антигенов наиболее удобной является «сэндвич»-модификация твердофазного иммуноферментного анализа. Использование в таком типе анализа двух моноклональных антител, взаимодействующих с разными эпитопами, позволяет сократить время анализа. Кроме того, такие пары моноклональных антител в ряде случаев обладают большей авидностью по сравнению с аффинностью каждого отдельного антитела. Для выявления антител, связывающихся с различными центрами на антигене, обычно используют три метода.
Первый заключается в химическом или ферментативном расщеплении взаимодействия с моноклональными антителами.
Второй метод основан на формировании преципитатов в случае, когда все молекулы антител связываются одновременно. Этот метод очень прост, однако обладает низкой чувствительностью.
Третий метод состоит в приготовлении моноклональных антител, меченных ферментом или радиоизотопом, и определении возможности меченых и немеченых моноклональных антител конкурировать за одни и те же центры связывания на антигене. Этот метод обладает высокой точностью, однако требует введения метки в каждый вид антител и оценки конкуренции для каждой пары. Этот метод не применяется, если необходимо проанализировать моноклональные антитела большого количества гибридом. Необходимо иметь в виду, что на ранних стадиях получения гибрддом количество имеющихся в наличии моноклональных антител ограничено. Это делает невозможным их отбор рассматриваемым методом.
Предыдущая << 1 .. 66 67 68 69 70 71 < 72 > 73 74 75 76 77 78 .. 123 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed