Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Метод может быть использован для вычисления констант связывания как поликлональных, так и моноклональных антител.
Моноклональные антитела и их применение в анализе
§ 1. Получение гибридом
Моноклональные антитела синтезируются отдельными клонами гибридных клеток (гиб-ридомами), которые впервые были получены в 1975 г. Келером и Милыитейном в результате соматической ¦ гибридизации клеток миеломных опухолей и В-лимфоцитов, продуцирующих анти7ела после иммунизации животных соответствующим антигеном. К настоящему времени отобраны такие варианты миелом (например, линии Х63-А8.6.5.3, р2/0-А и др), которые не способны синтезировать собственные иммуноглобулины, и вся «гибридомная продуктивность» выражается и синтезе огромного количества моноклональных антител с интересующёй исследователя специфичностью.
Другой особенностью используемых для гибридизации клеток миелом является отсутствие у них фермента гипоксантинфосфори-бозилтрансферазы, участвующего в синтезе ДНК- Этот фермент обеспечивает запасный путь синтеза аденозинмонофосфата в тех случаях, когда нормальная цепь ферментативных реакций заблокирована (например, в присутствии ингибитора — аминоптерина). На питательной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (НАТ-сре-да), такие миеломные клетки размножаться не способны. Вторым партнером для слияния служат иммунные лимфоидные клетки селезенки или лимфоузлов, которые сами по себе нежизнеспособны в культуре. Сомати-
ческая гибридизация клеток миеломы и лимфоцитов может осуществляться спонтанно, однако выход гибридом возрастает в присутствии 40—50% полиэтиленгликоля с Мг=4000 и 7,5% диметилсуль-фоксида. Высокий выход гибридом может быть получен в приборе для электрослияния.
Гибридомы отбиракрт по их свойству размножаться на НАТ-сре-де. Присущая миеломным клеткам способность к быстрому размножению восстанавливается за счет привнесения клеткам селезенки генов, ответственных за синтез предшественников ДНК по запасному пути. Селекция на НАТ-рреде позволяет избавиться от миелом-ных клеток и играет ключевую роль ввиду очень малого выхода процесса гибридизации (один гибрид на 500 тыс. клеток селезенки).
Далеко не все клетки, растущие на НАТ-среде, являются гибри-домами — продуцентами специфических антител. Это связано с тем, что часть лимфоцитов селезенки синтезирует иммуноглобулины неизвестной исследователю специфичности. Кроме того, на первых этапах роста после слияния гибридомы теряют некоторые хромосомы, а вместе с ними и способность к синтезу специфических антител. Поэтому важнейшим этапом получения гибридом является отбор клеток, стабильно синтезирующих антитела к антигену. Тестирование гибридом должно осуществляться на самых ранних стадиях после слияния и предполагает использование таких высокочувствительных методов, как иммуноферментный анализ. Содержание антител в культуральной жидкости на этих стадиях роста клеток составляет 10—100 нг/мл.
Однако выявленные на этой стадии антитела необязательно являются моноклональными. Это обусловлено тем, что в ячейке, где культивируют клетки, может оказаться две и более гибридом, каждая из которых синтезирует свой тип антител. Поэтому следующим шагом после селекции является клонирование гибридом, целью которого является разделение клеток и наращивание отдельных клонов из одной клетки. Клонирование осуществляют двумя основными способами — в полужидком агаре и методом предельных разведений.
При клонировании по первому методу клетки высевают иа питательную среду с агаром. Из каждой клетки в течение 8—10 дней вырастают колонии, видимые под микроскопом. Колонии могут быть отобраны из агара пастеровской пипеткой и перенесены в жидкую питательную среду для микротитрования таким образом, чтобы одна клетка попадала в каждые 3—6 лунок. Клоны, синтезирующие антитела нужной специфичности, сначала переносят в лунки больших размеров, а затем наращивают в специальных флаконах для культивирования. Важной особенностью клонирования является то, что оно позволяет не только избавиться от клеток, потерявших способность синтезировать антитела, ио и позволяет отобрать клоны нужной специфичности со стабильными наследственными свойствами. Основным критерием моноклонаЛьности
гибридомных антител является постоянство положения соответствующих моноклональным антителам белковых зон на изоэлектро-фореграммах после многократного клонирования.
Гибридомы, выращиваемые в сосудах для культивирования, синтезируют 5—10 мкг антител на 1 мл среды. При использовании специальных микроносителей типа «Биосилон», выпускаемых фирмой Нунк, количество антител увеличивается до 100 мкг/мл.
• Важнейшим свойством гибридом, унаследованным от миелом-ных клеток, представляется их способность давать асцитные опухоли при введении мышам и синтезировать при этом до 15 мг антител на 1 мл асцитной жидкости.
Химическая модификация молекулы антитела при получении конъюгатов в некоторых случаях может приводить к уменьшению констант связывания в 10 раз и более. Это послужило одним из стимулов для получения гибридных моноклональных антител, содержащих два различных антигенсвязывающих центра, один из которых направлен к определенному антигену, а другой — к ферменту, используемому в качестве метки. Можно ожидать, что гибридные моноклональные антитела окажутся ценным терапевтическим средством, поскольку одновременно позволяют вводить в организм лекарственные соединения и осуществлять их направленный транспорт.
