Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Первой стадией при создании гибридных моноклональных антител является получение обычной гибридомы, синтезирующей моноклональные антитела желаемой специфичности к одному из двух антигенов. Затем гибридому адаптируют к росту в присутствии 8-азогуанина и отбирают те клетки, которые способны размножаться на НАТ-среде. Эти первичные гибридомы, выступающие в роли миеломного партнера, подвергают слиянию с иммунными лимфоцитами мышей, иммунизированных вторым антигеном. В результате слияния и отбора получают дочерние (вторичные) гибридомы, способные синтезировать антитела двойной специфичности. Таким способом были получены гибридные моноклональные антитела, которые одновременно связывались с кислой фосфатазой простаты человека и поверхностным антигеном гепатита В. Гибридные антитела оказались стабильными в процессе хранения, не изменяли своей двойственной специфичности и обладали достаточно высокими константами связывания по отношению к обоим антигенам. Гибридные антитела, взаимодействующие с пероксидазой и соматотропи-ном, были успешно использованы для изучения локализации сома-тотропина в клетке.
В настоящее время в основном получают гибридомы, синтезирующие моноклональные антитела мышиных или крысиных изотипов. Выбор животных определяется наличием соответствующих миелом-ных линий. Однако мышиные моноклональные антитела не всегда можно применять в медицинских целях. Для получения изотипов человека были сделаны попытки гибридизации крысиных миелом с
человеческими лимфоцитами. Однако практического значения такие гибридомы не нашли из-за генетической нестабильности. Более успешным оказались эксперименты, в которых для слияния используют лимфоциты периферической крови человека и человеческие опухолевые клетки. Такие гибридомы синтезируют моноклональные антитела к антигенам, участвующим в возникновении аутоиммунных заболеваний.
Получение моноклональных антител с более низкой антигенно-стью по отношению к человеку может быть осуществлено с помощью генноинженерных методов. Моноклональные антитела, созданные с помощью этого подхода («химерные»), включают активный центр из иммуноглобулина мыши, а остальную часть молекулы, Fc-фраг-мент, — из иммуноглобулина человека.
Методы по получению моноклональных антител постоянно развиваются и совершенствуются. Это позволило расширить границы их применения в практических целях и сделать целый ряд открытий теоретического характера в области молекулярной биологии и иммунохимии.
Получение гибридомы, синтезирующей моноклональные антитела к инсулину. Материалы.
1. Полная среда Дульбекко в модификации Игла (ДМЕМ-среда): 450 мл ДМЕМ; 5 мл пирувата натрия (100 мМ); 5 мл пенициллина и стрептомицина (10 000 ед. в 1 мл); 5 мл L-глутамина (200 мМ); 0,25 мл 2-меркаптоэтаиола (0,1 М); 50 мл фетальиой сыворотки теленка.
2. НАТ-среда и НТ-среда. Содержат 1-10~4 М гипоксантина, 1,6-10—5 М тимидииа, 4-10~7 М амииоптирина в полной ДМЕМ-среде.
3. Солевая среда, содержащая глюкозу (автоклавируется или стерилизуется фильтрованием): 8 г NaCl; 0,4 г КС1; 1,77 г Na2HP04X2H20; 2 г глюкозы; 0,01 г фенолового красного; вода до 1 л.
4. «Сшивающий» раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ): 50% ПЭГ, Afr=4000; 45% солевой среды, содержащей глюкозу; 5% диметилсульфоксида.
5. Замораживающая среда: 9 мл сыворотки (фетальной или лошадиной); 1 мл диметилсульфоксида.
Иммунизация мышей. 30—50 мкг инсулина растворяют в 0,1 мл 0,15 М раствора NaCl, pH 7,4; смешивают с равным объемом адъюванта Фрейнда и вводят мышам внутрибрюшинно. Через 4—5 недель повторно вводят 30 мкг инсулина в неполном адъюванте Фрейнда внутрибрюшинно. За 3—4 дня до слияния вводят 20 мкл инсулина без адъюванта внутрибрюшинно и 10 мкг внутривенно.
Слияние клеток. Селезенку иммунизированной мыши измельчают в стеклянном гомогенизаторе, заполненном солевой средой с глюкозой. 108 селезеночных клеток и 2-107 миеломных клеток мыши промывают солевым раствором с глюкозой, центрифугируют 10 мин при 200g. Надосадочную жидкость осторожно удаляют пипеткой. К осадку в течение 1 мин по каплям добавляют 0,5 мл «сшивающего» раствора ПЭГ, разбивая осадок. Суспензию оставляют стоять
10 мин, после этого разбивают комки клеток пропусканием через пипетку. Клетки суспензируют в 50 мл НАТ-среды и разливают по
100 мкл в 96-луночные микроплаты, содержащие 15 000 перитональ-ных макрофагов на лунку.
Клетки выращивают в увлажненном термостате при 37°С в атмосфере 5% С02. Через первые 3 дня, а затем дважды в неделю 7з среды удаляют пастеровской пипеткой и заменяют свежей НАТ-средой. Через 7—10 дней НАТ-среду заменяют НТ-средой. Когда растущие на селективной среде клетки занимают 10—20% площади лунки, недостаточную, культуральную жидкость тестируют на наличие специфических антител.
Тестирование гибридом. Пипеткой удаляют по 50 мкл среды из каждой лунки платы для культивирования и переносят среду в лунки полистирольных плат, на поверхности которых сорбирован антиген. Инкубируют 1 ч при 37°С и отмывают непрореагировавшие компоненты 0,01 М фосфатом натрия, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% твин-20 (ФБРТ). В лунки добавляют 50 мкл конъюгата! кроличьих антимышиных иммуноглобулинов с пероксидазой, растворенного в фосфатном буфере с тритоном (ФБР), содержащем 0,5% бычьего сывороточного альбумина, инкубируют 1 ч при 37°С, после чего промывают лунки ФБТ 3 раза. Для определения ферментативной активности лунки заполняют 0,2 мМ раствором ABTS в 0,05 М цитратном буфере pH 4,0, содержащем 0,1 мМ Н2О2. Результаты реакции учитывают через 30 мин, проводя измерения на фотометре при 412 нм.
