Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Метод аффинной хроматографии на иммуносорбентах используется для получения препаратов очищенных антител. Наиболее широкое распространение лолучили иммуносорбенты на основе CNBr-активированной сефарозы (фирма «Farmacia», Швеция). Выпускаемая в нашей стране CNBr-активированная агароза по своим основным параметрам (удельной емкости, отсутствию неспецифической сорбции) не уступает зарубежному аналогу.
Основные операции, используемые для получения иммобилизованных на CNBr-агарозе антигенов или антител, приведены в табл. 5.1.
Следует отметить, что при работе с иммуносорбентами на основе CNBr-активированной сефарозы нельзя использовать буфер, содержащий аминогруппы (например, трис-буфер).
Получение фрагментов антител. При разработке некоторых модификаций ИФА может возникнуть необходимость использования конъюгатов фермента не с целой молекулой иммуноглобулина, а с тем ее фрагментом, который специфически связывается с молекулой антигена — Fab-фрэгментом. Обусловлено это прежде всего тем, что Fc-фрагмент молекулы, ответственный за эффек-торные функции иммуноглобулина, обладает способностью неспецифически взаимодействовать с другими белками, сорбированными на носителях при проведении твердофазного ИФА. Эффект неспецифической сорбции определяется природой антигена, концентрацией сорбированного на носителе белка и рядом других факторов.
Получение Р(аЬ')2-фрагментов.
1. Раствор антител (10—20 мг/мл) диализуют против 0,1 М Ха-ацетатиого буфера, pH 4,5, при +5°С.
2. Затем в раствор антител вносят пепсин из расчета 0,2 мг на 10 мг IgG.
3. Смесь инкубируют при 37°С в течение 15—24 ч. Длительность инкубации
Операция Условия
1,. Взвесить требуемое количе 1 г высушенного препарата дает около
ство CNBr-активированион сефа- 4,5 мл геля
розы Использовать для промывки раствор 1 мМ
2. Промыть на стеклянном НС1, а затем для уравновешивания и набу
фильтре и дать набухать гелю хания --- боратный или гидрокарбонатный
3. Растворить в буфере белок буфер
(антиген) Использовать гндрокарбонатный или об
4. Смешать белковый раствор с ратный буфер
суспензией геля Гидрокарбона,тиый буфер: 0,1 М NaHC03
5. Блокировка оставшихся ак (pH 8,3), содержащий 0,5 NaCl
тивных групп Раствор должен содержать 5---10 мг ан
6. Отмывка от иесвязавшегося тигена
антигена Два часа при комнатной температуре или
ночь при +4 °С
Гель промывается буфером, содержащим
блокирующие соединения (16 ч при 4 °С или
2 ч при комнатной температуре). Исполь
зуются 1М этаиоламин или 0,2 М глицин,
pH 8,0
Используется буфер, в котором осу
ществлялось ковалентное связывание (бо
ратный или гидрокарбонатиый), затем 0,1 М
ацетатный буфер, pH 4, содержащий
0,5 М NaCl, после, чего гель опять уравно
вешивается боратным или гидрокарбонат-
ным буфером
зависит от препарата пепсина и вида животного, от которого получена антисыворотка.
4. pH рйствора доводят 1М NaOH до 8.
5. Затем раствор IgG в буфере pH 8,0, обработанный пепсином, наносят на колонку с сефадексом G-150 (либо ультрагелем АсА-44). При объеме смеси 1,0— 1,5 мп используют крлоику 1,5X45 см, а при 2,0—2,5 мл — 2,0X45 см. Колонку предварительно уравновешивают 0,1 М Na-борэтным буфером, pH 8,0. Гель-фильтрация на АсА-44 приводит к более четкому отделению F(aB')2, чем сефа-декс G-150. Для IgG овец, морских свинок, козла и, возможно, Некоторых других животных гельфильтрацию следует проводить в буфере pH 6—7, а ие 8, поскольку изоэлектрическая точка этих белков близка к 8. Добавление в буфер для элюции БСА позволяет снизить уровень неспецифической еорбции в случае использования низких концентраций IgG.
' 6. Концентрацию Р(аЬ')2-фрагмента рассчитывают, используя коэффициент молярного поглощения eF(ab')« ~ г~ьл--см—
Получение Fab-фрагментов
1. Готовят раствор, содержащий 0,1—3 мг Р(аЬ')2-фрагмента в 0,45 мл
0,1 М Na-фосфэтиом буфере, pH 6,0. •
2. Добавляют 0,05 мл 0,1 М 2-меркаптоэтанола в том же буфере, содержащем 5 мМ ЭДТА.
3. Смесь инкубируют при 37 °С в течение 1,5 ч,
