Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Постановка метода включает две основных стадии: 1) проведение реакции антиген — антитело в растворе; 2) определение концентрации антител после установления равновесия с помощью метода твердофазного ИФА. Схема реакции в растворе в общем случае имеет вид
Ar-J-Ат^ АгАт. ;
Обозначим равновесную концентрацию связанных антител как Вр, а концентрацию свободного антигена как Fj,, тогда можно записать следующее выражение (известное как уравнение Клотца):
_И|к = _Ь- + 1; (5.1)
В р Гр
Яр = 1Ат]0-1Ат]; (5.2)
Fp=[Ar]0-5p. (5.3)
Если концентрации антител [Ат] 0 и [Ат] определять методом непрямого твердофазного ИФА, то при определенных условиях проведения эксперимента .будет выполняться соотношение [Ат]/ [Ат]о=Л/Ло, где А и А0 — значёния оптических плотностей, регистрируемых в ИФА, соответствующие концентрациям антител [Ат] и [Ат]0. Уравнение Клотца при этом условии может быть приведено к виду
---1 j-------------------К*---------. (5.4)
ГА 1 П 1 Л°-Л
[Аг]0 - [Ат]0------ '
0 •
Таким образом, для определения Кл описанным выше методом необходимо знание начальной концентрации антител [Ат] о. Однако практически нахождение Кл проводится в иммунных сыворотках, или асцитах, где точная концентрация антител [-Ат]0 неизвестна. Если проводить реакцию комплексообразоваиия в избытке антигена, то количество связавшегося антигена незначительно по сравнению с исходным и его концентрация после установления в системе равновесия будет близка к исходной т е. [Ar]0».Fp. Если эксперимент проводится так, что выполняется условие [Аг] о >10[Ат] о, то
[Ат]0-4^-«;[Аг10,- - (5.5)
ченные радиоактивной меткой (не вносящей существенных изме- ' нений в структуру антигена).
При использовании ферментных меток химическая структура меченого антигена может существенно отличаться от немеченого (так, например, могут быть получены конъюгаты с различным мольным соотношением антиген/фермент). В этих случаях полученные значения констант связывания характеризуют, как правило, взаимодействие в данг ной конкретной системе, вследствие” чего иммунная сыворотка, обладающая высокой аффинностью в реакции с конъюгатом одной структуры, может иметь значительно более низкие значения константы связывания с конъюгатом, полученным другим способом.
Если исследователь имеет
1,0 2,0 3,0 дело с разработкой конкурент-
lg [И'нс -ПК], [нг/мл] НЫх методов ИФА, т. е. распо-
лагает набором иммунных сы- .
пГ Инсу‘ вороток и конъюгатом анти-
лин — пероксидаза (Инс — 11л) с ад- . .
сорбированными на полистирольном- ген фермент, то важным эта-планшете антителами против инсулина, ПОМ создания тест-системы ЯВ-выделенными из разных сывороток: ляется выбор пары антитело—
4М°НМ продукта"”перокснм^но^р^аыщн^оюк;1- конъюгат, характеризующейся
лення о-феннленднамнна перекисью водорода. НбОбхОДИМОЙ КОНСТаНТОЙ ВЗаИ' Константы связывания антител нз сывороток » г-г
1 и 2 (в М—*) равны 1010 н 109 соответствен- МОДбИСТВИЯ. «ДЛЯ ПрОВбДбНИЯ
но; N — контрольная нормальная сыворотка СКрИНИНГЭ у-ТЛОбуЛИИОВуЮ
фракцию каждой антисыворот-
ки иммобилизуют на поверхности микропланшета и изучают ее связывание с имеющимся набором конъюгатов. Эффективное зна-
чение /Ссвяз является величиной, обратной значению концентрации конъюгата, при которой связывается 50% активных центров на носителе.
На рис. 19 приведены кривые связывания иммобилизованных
на полистироле антител к инсулину с конъюгатом инсулин — пероксидаза. Исследуемые сыворотки различаются по значениям эффективных констант равновесия. Для количественного определения инсулина могут быть использованы антисыворотка и конъюгат, эффективная константа связывания которых ~109 М-1. Для других тест-систем допустимое значение Кэф будет определяться требованиями, предъявляемыми к чувствительности и точности
разрабатываемого метода.
Описанная процедура скрининга иммунных сывороток, как отмечалось выше, применима при наличии конъюгата антиген — фер-
мент. Получение такого конъюгата для широкого круга антигенов представляется непростой задачей. Более универсальным реагентом (коммерческим) являются антитела, меченные ферментом, поэтому остановимся на более общем подходе к определению аффинности антител в сыворотке или асците, основанном на твердофазном ИФА. Этот метод, предложенный Б. Фриге, позволяет определять константу связывания антител с антигеном (немечен-ным) при их взаимодействии в растворе.
Постановка метода включает две основных стадии: 1) проведение реакции антиген — антитело в растворе; 2) определение концентрации антител после установления равновесия с помощью метода твердофазного ИФА. Схема реакции в растворе в общем случае имеет вид
