Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Способы иммунизации. Введение иммуногена приводит к активации лимфоидных клеток, расположенных вблизи от места инъекции. Наиболее эффективно вводить иммуноген малыми порциями в большое количество точек. Введение иммуногена можно осуществлять различными способами.
Внутрикожное введение. На очищенном от шерсти участке кожи животного делают острым'скальпелем несколько царапин, а затем втирают в это м-есто раствор иммуногена (25 мкл). Применение этого способа позволяет получать высокий иммунный ответ уже после однократного введения, в результате чего значительно сокращается расход иммуногена. Однако описанный способ трудоемок в исполнении и обычно вызывает сильные болевые ощущения у животного от обширных участков изъязвлений в местах введения иммуногена.
Подкожная иммунизация. В точки, расположенные вдоль позвоночника животного, вводят 5—6 порций раствора иммуногена объемом приблизительно 2 мл.
Внутримышечное введение. Одновременно часть иммуногена вводят в мышцу задних ног животного и небольшими порциями.
Внутриррюшинное введение. Этот способ используют для иммунизации мелких лабораторных животных, таких, как мыши или морские свинки.
Прямое введение иммуногена в лимфатические узлы. Иммуноген инъецируют в лимфоидные узлы, расположенные в подколенной ямке задних ног кролика, что позволяет уменьшить его количество до 10—50 мкг, а объем вводимого раствора — до 25 мкл. Этот способ является сложным в техническом исполнении, по-
скольку включает в себя разрез кожи, поиск лимфоузла и введение иммуногена без его повреждения.
Внутривенное введение. Этот способ обычно применяется для повторных инъекций, после которых проводят отбор крови у животного. Раствор иммуногена вводят непосредственно в кровоток (в вену уха кролика, в яремную вену барана или козы). Адъювант в этом способе введения антигена не применяется, поскольку он оказывает токсический эффект и животное может погибнуть.
Более редко используются такие способы иммунизации, как введение иммуногена в подушечки лап или в конъюнктиву глаза, которые вызывают сильные болевые ощущения у животного. Иммунизацию начинают введением животному иммуногена в смеси с полным адъювантом Фрейнда, а для повторных инъекций применяют неполный адъювант Фрейнда. Перед отбором крови за 7—
9 дней проводят 1—3 внутривенных инъекций для повышения уровня антител. Число инъекций и интервалы иежду ними чаще всего подбираются экспериментально для конкретного иммуногена.
В процессе иммунизации у животных отбирают небольшие пробы крови для оценки количества антител. Максимальный уровень иммунного ответа на введение большинства растворимых антигенов (белков, полисахаридов и т. д.) достигается через 40—60 дней после первой инъекции. В том случае, когда иммуногеном являются клетки микроорганизмов, максимально высокий уровень антител наблюдается гораздо раньше (через 12—20 дней). После окончания первого цикла иммунизации животному в течение 30 дней дают восстановить здоровье и проводят реиммунизацию (2-й цикл иммунизации), включающую 1—3 внутривенные инъекции. Ниже приводятся схемы иммунизации морских свинок и кроликов инсулином и конъюгатом тироксин — бычий сывороточный альбумин (БСА).
Для получения антисывороток морских свинок к инсулину свиньи (крупного рогатого скота) проводят многоточечные инъекции инсулина подкожно, внутримышечно и внутрибрюшинно по следующей схеме: 1, 8, 15-й день — 200 мкг инсулина в 0,5 мл физиологического раствора смешивают с 0,5 мл полного адъюванта Фрейнда и вводят животному. После 30 дней отдыха животному в течение 3 дней ежедневно вводят антиген путем многоточечных инъекций по схеме: 45, 46, 47-й день — 150 мкг инсулина в 0,7 мл физиологического раствора. Отбор крови проводят через 7—9 дней из сердца.
Второй цикл иммунизации осуществляется после месячного отдыха живот-•ных по схемам 45, 46 и 47 дней.
Для получения антисывороток с титром, удовлетворительным для проведения ИФА, часто требуется 4—5-кратное повторение циклов иммунизации. Отбор крови каждый раз проводится на 7— 9-й день после последней инъекции.
Иммунизацию кроликов конъюгатом тироксин — БСА (Т4 — БСА) проводят многоточечными инъекциями вдоль позвоночника и внутримышечно в область микроузлов задних лап по следующей схеме: 1-й день — 1—2 мг конъюгата
Т« — БСА в 0,7 мл физиологического раствора смешивают с 0,7 мл адъюванта Фрейнда и полученную эмульсию вводят животному; 31, 32, 33 или 45, 46, 47-й дни — внутривенно вводят 0,7—1 мл физиологического раствора, содержащего 1—2 мг Т4—БСА.
Кровь берут из сердца на 7—9-й день после последней инъекции. Через месяц цикл внутривенной иммунизации .повторяют.
Отбор крови и получение антисыворотки. Иммунизированное животное используется в качестве донора иммунной сыворотки в течение 5—7 мес, за это время удается провести 5—6 циклов иммунизации. Животных, прошедших несколько циклов иммунизации, называют гипериммунными. Кровь у животных отбирают из вены уха (кролик) или непосредственно из сердца путем кардиальной пункции (кролик, морская свинка) в объеме 50—70 мл у кролика и 5—10 мл у морской свинки в стерильные пробирки, промытые стерильным буферным раствором.
