Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
• Как правило, метод равновесного диализа применяется для низкомолекулярных соединений (гаптенов) с Мг<3000. Это обстоятельство существенно ограничивает область использования метода. К недостаткам метода надо также отнести относительно большое время достижения равновесия (более 24 ч) и необходимость учета эффектов, вызываемых присутствием мембраны (не-Специфическая адсорбция реагентов на поверхности мембраны), в результате чего необходимо работать с достаточно высокими концентрациями реагентов, что значительно понижает чувствительность определения константы связывания.
Методы фракционного осаждения используются для разделения комплексов антиген — антитело и несвязавшегося антигена. Они основаны на способности высокомолекулярных комплексов антигеи—антитело избирательно осаждаться различными реагентами (полиэтиленгликолем, сульфатом аммония, этанолом, вторичными антителами). При установлении в системе равновесия осаждающий реагент добавляют в такой концентрации* при которой комплекс антиген—антитело и несвязавшиеся антитела становятся нерастворимыми и выпадают в осадок, который легко может быть удален центрифугированием.
Методы, не включающие фазовое разделение вступившего и не вступившего в реакцию антигена, относятся к группе гомогенных методов.
Флуоресцентные методы основаны на способности остатков триптофана в молекулах белков флуоресцировать (330—360 нм) при возбуждении УФ светом (280 нм). Взаимодействие ряда антигенов с антителами приводит к изменению интенсивности флуоресценции, что может быть использовано для оценки количе-
Таблица 2.1. Методы определения аффинности антител
Методы Используемые антигены
Равновесный диализ Гаптены, диализуемые антигены
Осаждение глобулиновой фракции Гаптены, антигены, растворимые
сульфатом аммония при 50%-ном насыщении сульфатом
Осаждение углем, модифицированным аммония
декстраном Г аптены
Осаждение антиглобулинами Гаптеиы, белки, полисахариды
Гельфильтрация, разделение по моле Гаптены, белковые полисахариды
кулярной массе Гаптены и антигены со специфиче
Тушение флуоресценции скими флуоресцентными свойствами
Усиление флуоресценции Гаптеиы, белки
Поляризация флуоресценции Г аптены, белки
Спектральные методы Гаптены, связанные с красителем
Тушение биолюминесценции Г аптены, белки
ства антигена, вступившего в реакцию с антителами. В зависимости от химической структуры антигена (или гаптена) может •наблюдаться как усиление, так и гашение флуоресценции. Степень гашения (или усиления) интенсивности свечения зависит от концентрации активных центров антител, константы их ассоциации с антигеном и пропорциональна концентрации образовавшихся специфических комплексов. Методы флуоресценции просты, не занимают много времени (10—20 мин) и имеют высокую чувствительность, что сокращает расход реагентов.
Метод деполяризации флуоресценции основан на измерении поляризации флуоресценции антигена, меченного красителем, до взаимодействия с антителами и после комплексообразования. Поляризация флуоресценции определяется молекулярным объемом частицы и степенью ее асимметрии. Комплексообразование антигена с антителом сопровождается резким изменением поляризации флуоресценции красителя (например, дансила), который играт роль метки антигена или антитела. Предел обнаружения антигена этими методами достаточно мал (10^9—10-10 М).
• Недостатками методов, основанных на измерении флуоресценции, являются необходимость работы с препаратами очищенных
антител и строгие требования к структуре изучаемых антигенов. Вследствие этого флуоресцентные методы не являются универсальными и могут быть применены для ограниченной группы антигенов.
Методы тушения биолюминесценции основаны на использовании в качестве маркера АТР, пришитой к' молекуле антигена. В составе такого комплекса молекула АТР сохраняет активность в реакции биолюминесценции, катализируемой еветлячковой люциферазой. При добавлении антител образуется комплекс с антигеном, в котором молекула АТР становится недоступной ферменту, в результате чего ингибируется реакция биолюминесценции. Указанный метод обладает высокой чувствительностью, что позволяет измерять константы ассоциации до 10-12 М.
Перечень экспериментальных методов определения аффинности взаимодействия антиген — антитело приведен в табл. 2.1.
§ 4. Способы расчета констант комплексообразования реакции антиген — антитело
Взаимодействие одной субпопуляции антител с моновалентным антигеном. Этот наиболее простой случай реализуется, например, при связывании гаптена с Fab-фрагментами моноклональных антител и описывается простейшей схемой (3.1).
Из системы уравнений материального баланса | [Ат]0=[Ат]-f-[Ar>Ат]
