Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Уравнение Скэтчарда в этом случае принимает вид
lAr-Al.IКп [Аг]0 — К [Аг-Ат]. (3.25)
[Ат]
Варьируя концентрацию антител в системе при постоянной концентрации [Аг]о, можно определить константу комплексообразо-вания К и число мест связывания 6 антигене п.
Так как молекулы антител обладают, по крайней мере, двумя центрами связывания, то при взаимодействии с поливалентным антигеном возможно образование так называемых комплексных связей, когда после взаимодействия одного активного центра молекулы антитела с одним из эпитопов второй активный центр взаимодействует с расположенным поблизости вторым эпитопом той же молекулы антигена. Общая эффективность взаимодействия в этом случае существенно возрастает; в частности, эффективная константа комплексообразования для молекулы lgG может в 103 раз и более превышать Ко одиночных связей. Частота образования таких связей зависит оТ концентрации реагентов и может колебаться от нуля до максимальной, соответствующей общему количеству молекул lgG в Системе.
Взаимодействие двух субпопуляций антител с моновалентным антигеном. Одним из простых приближений при описании реальных систем взаимодействия моновалентного антигена (гаптена) с антителами может быть модель, согласно которой набор популяций антител заменяется двумя — высокоаффинной и низкоаффинной, каждая из которых характеризуется собственной константой комплексообразования — Ki и Кг. Задача определения констант и концентраций каждой из фракций антител перед экспериментаторами возникает часто. Знание численных значений этих параметров весьма важно для разработки конкретных наборов для иммуноферментного анализа и выбора схемы проведения имму-
ноанализа с целью достижения требуемой чувствительности определения антигена и специфичности анализа.
В условиях равновесия рассматриваемая схема взаимодействия
Ar + ATi^t Ar-ATt
Ar-f Ат25^ Аг-Ат2 (3.26)
описывается системой следующих алгебраических уравнений: к- tAr-A.TjL; к [Аг-_аТ2]_ (327)
[Аг] [Atj] 2 [Аг] [Ата!
i Arid=[ Аг] + [Аг • Ат,1 + [ Аг • Ат2];
lAT1J0=[AT114-[Ar-ATlI; [Ат2Ь=[Ат21 + [Аг - Ат2]. (3.28)
Опуская алгебраические преобразования (читатель может найти детальное описание аналогичной системы, например, в книге Варфоломеева С. Д. Зайцева С. В.), дадим окончательное выражение зависимости, описывающей связь параметров системы в координатах Скэтчарда:
y-=Y ^i([Ati1q-j5)+/C2([At21°-jS)+
+К[^1([Ат1]о-^)+^2([Ат2]0-5)]2+4/С1/С25([Ат110 + [Ат210-5)]1
(3.29),
где 5 = В]+В2=[Аг-ATi]+[Ar-Ат2]; F==[Ar]. Графическая зависимость B/F от В имеет вид гиперболы (рис. 13). Таким образом, получаемая при анализе зависимости связывания неизвестной популяции антител с антигеном в координатах Скэтчарда вогнутая кривая может свидетельствовать о существовании двух фракций антител — высокоаффинной и низкоаффинной. (Следует указать, что аналогичные зависимости могут наблюдаться и в более сложных случаях существования трех и более популяций антител, а также при отрицательной кооперативное™ связывания поливалентного антитела с лигандом.)
Для определения четырех неизвестных параметров — Ki, Ка, [AtJo и [Ат2]0 можно воспользоваться одним из следующих методов.
1. Параметры можно оценить по углам наклона асимптот гиперболы и отрезкам, отсекаемым ими на оси абсцисс и ординат (рис. 13). Для построения асимптот используют следующий прием. По концевым участкам экспериментальной кривой проводят прямые, которые дают первоначальное приближение констант Ki и Ка (tga»/C'i; tg р»К'а)-Путем параллельного перемещения прямых подбирают такое их положение, чтобы сумма отрезков, отсекаемых ими на осях координат, была равна соответствующим
отрезкам на тех же осях, отсекаемых самой кривои при экстраполяции ее к осям координат:
OC—ON4-OP;
(3.30)
OA=OM+OQ. ’
Отрезки на оси абсцисс ОМ и оси ординат ON дают оценочные значения для [Ati]0 и [Ат2]о соответственно. Подставляя оценочные значения К\, К2, [Ат^ и [Ат2]0 в выражения для В\ и В2 [Ат!]0 [Аг] /Сг .
1 + Ki [Аг]
[Ат2]ь [Аг] АГа 1+/С2[Аг]
(3.31)
(3.32)
Рис. 13. Определение констант связывания двух субпопуляций антител с ионовалентным антигеном
Рис. 14. Графический способ нахождения асимптот для расчета констант связывания двух субпопуляцнй антител с моновалентным антигеном
находят приближенные параметры Bi и В2 и В=В1-\-В2 при различных концентрациях Аг.
С использованием полученных значений строят теоретическую зависимость B/F от В, сравнивают ее с экспериментальной и подбирают новые оценочные параметры до наилучшего совпадения теоретической и экспериментальной кривой.
