Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
I [Аг]0=[Аг]+[Аг.Ат] ( ' ’
с учетом (3.3) для константы равновесия комплексообразования можно легко получить выражения равновесной концентраций образовавшегося комплекса
1Аг-Ат]= *[АтЫАг1 . ’ (3,17)
1 J I ч- AT [Аг] v '
1. Один из часто используемых способов расчета константы состоит в исследовании зависимости образующегося комплекса от общей концентрации антигена [Аг]о. Если при достаточно больших концентрациях антигена в системе выполняется условие [Аг]о^>[Ат]о, то (3.17) принимает вид
1Аг-Ат]=~^[-У—1о....... (3.18)
J I + * [Аг]0 к '
Эта зависимость (рис. 9) является аналогом изотермы адсорбции Лэнгмюра в теории адсорбции или уравнения Михаэлиса—Мен-теи в ферментативной кинетике. Из выражения (3.18) следует,
что при предельных значениях концентрации [Аг]0 концентрация комплекса [Аг-Ат] стремится к общей концентрации центров связывания [Ат]0. Для вычисления К определяют концентрацию антигена [Аг]'о, при которой половина антител находится в виде комплекса с антигеном ({Аг-Ат]=[Ат]о/2). С учетом выражений
(3.16) и (3.17) можно получить
[Ar]S=-i-+J^k-- (ЗЛ9>
К
Из выражения (3.19) следует, что [Ar]'o = l/i( при условии 1//С^>[Ат]0 (т. е. либо антитела являются низкоаффинными; либо их концентрация мала). При обратном соотношении (1/Ж[Ат]0) данный метод определения К неприемлем.
[Дг-Дт]
Рис. 9. Зависимость концентрации образующегося комплекса [Аг-Ат] от общей концентрации антигена в растворе [Аг]0
Рис. 10. Графическое определение константы связывания в двойных обратных координатах
2. Иногда для вычисления константы связывания К используют представление экспериментальных данных зависимости (3.19) концентрации комплекса от концентрации свободного антигена в системе двойных обратных координат:
____!______!______l_J (3 20)
[Аг-Ат] К[АтЪ [Аг] [Ат]„ ' V ‘
При постоянной концентрации антител в системе варьируют начальную концентрацию антигена и в условиях равновесия определяют концентрацию свободного и связанного в комплекс антигена. График в двойных обратных координатах представляет собой
прямую линию с тангенсом угла наклона ----------------, отсекающую
К [Ат]о
на оси ординат отрезок 1/{Ат]0 (рис. 10). В условиях избытка антигена ([Аг]3>[Ат]0) анализ проводят в координатах 1/[АгХ ХАтН-1/[Аг]0.
3. Наиболее часто для анализа комплексообразования используют метод Скэтчарда, основанный на исследовании зависимости отношения равновесной концентрации комплекса [Аг-Ат] к концентрации свободного антигена [Аг] от концентрации комплекса.
Аналитический вид уравнения Скэтчарда легко получить из выражения для константы кймплексообразования (3.3) и уравнения материального баланса (3.16):
[Аг-Ат]
[Аг]
= АГ [Ат]0 — АТ [Аг-Ат].
(3.21)
Рис. 11. Графическое определение константы связывания в координатах Скэтчарда
Рис. 12. Графическое опредеелние константы связывании в координатах Хилла
В литературе часто эти координаты обозначают в символах B/F-^-B (В — от английского слова bound — связанный, F — /гее— свободный). Зависимость Скэтчарда имеет вид прямой с тангенсом угла наклона — К, отсекающей на оси ординат отрезок К [Ат]о, а на оси абсцисс [Ат]0 (рис. 11). Графическая обработка экспериментальных данных в координатах Скэтчарда позволяет вычислить не только равновесную константу связывания, но и концентрацию активных центров антител [Ат]0 в системе.
На практике при нахождении константы данным способом проводят серию опытов по определению равновесной концентрации свободного антигена (или комплекса) при различных начальных концентрациях антигена и постоянной концентрации антител в системе.
4. В качестве еще одного преобразования уравнений (3.3) и
(3.16) используют следующее:
____[Аг-Ат]
-К [Аг].
(3.22)
([Ат]0 — [Аг-Ат])
Разделив числитель и знаменатель части равенства на концентрацию антител [Ат]0 и логарифмируя выражение, получаем [Аг.Ат]/[Ат]0
I — [Аг-Ат]/[Ат]о
=lg/C+lg[Ar].
(3.23)
В координатах lg-------^^^-------------*-^[Аг], называемых коор-
1 — [Аг.Ат]/[Ат]0
динатами Хилла, должна получаться прямая с тангенсом угла наклона, равным единице, пересекающая ось ординат в точке 1 gK (рис. 12).
Взаимодействие одной субпопуляции антител с поливалентным антигеном. Рассматриваемый ниже случай может реализоваться, например, при связывании Fab-фрагментов моноклональных антител с клетками, вирусными частицами и т. д., имеющими на своей поверхности большое число одинаковых центров связывания. Выражение для константы равновесия взаимодействия антитела, имеющего по п эпитопов, записывается следующим образом:
----------[Аг-Ат]----------=к ^324j
(л [Аг]0-[Аг-Ат]) [Ат]
