Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Распределение Сипса является симметричным и унимодальным и может быть полностью охарактеризовано средней константой аффинности Ко и индексом гетерогенности «а». Произвольное предположение о симметричном распределении антител по аффинности имеет свои ограничения. Истинная форма распределения остается неизвестной. Часто все же на практике используют распределение Сипса для описания гетерогенной популяции антител. В действительности распределение антител по К бывает несимметричным и мультимодальным, поэтому, строго говоря, распределение антител по аффинности нельзя аппроксимировать распределением Сипса.
В частности, например, описаны распределения, сильно смещенные в сторону антител с низкой аффинностью. . Вследствие этого представление всей популяции антител как популяции, взаимодействующей с одной средней аффинностью (Ко) или даже как бимодальной (Ко высокоаффинная и Ко — низкоаффинная), не всегда точно отражает распределение антител по аффинности.
В предположении об отсутствии внутри- и межмолекулярных взаимодействий Муккур с сотрудниками ввели понятие об общей константе аффинности Ки представляющей собой сумму произведений равновесных констант каждой из пг субпопуляций антител на множители, учитывающие концентрационный вклад каждой из фракций в общей популяции антител:
т. е. общая константа аффинности для гетерогенной популяцш является средневесовым параметром и представляет собой сумму средневесовых аффинностей иг-субпопуЛяций в реакционной смеси. Концентрацию антигена, связанного в комплексы с антителами, можно представить в виде
Можно показать, что предельное значение функции Q(fAr]), являющейся формальным выражением для константы равновесия,
m г ft 1 г/
К
[Ат Ло/С/
(3.12);
m
(3.13)
([Ат]0 - В) [Аг]
при концентрации [Аг}->-0 приближается к Kt'
lim Q=Kt. (3.15)
[Аг]-*0
Для гетерогенной популяции антител Q зависит от равновесной концентрации [Аг] в системе, а графически зависимость IgQ от [Аг] имеет вид кривой с отрицательным наклоном. Экстраполируя экспериментальную зависимость IgQ от [Аг] к нулевой концентрации [Аг]=0, можно получить предельное значение Q, равное Kt. Для гомогенной популяции Q| не зависит от [Аг] и представляет собой истинную константу связывания Ко-
§ 3. Методы определения аффинности антител
Определение аффинности (или константы связывания) антител в сыворотке или выделенных в очищенном виде представляет собой сложную экспериментальную и теоретическую задачу. Трудности обусловлены следующими обстоятельствами.
Во-первых, гетерогенностью антител по физико-химическим свойствам, в том числе по сродству к антигену. Во-вторых, сложностью определения общего количества антител, а также отдельных фракций. В-третьих, в случае поливалентных антигенов возможностью образования комплексов сложного состава, в том числе циклической структуры, в которых проявляется кооператив-ность взаимодействия активных центров антител. Все это не позволяет применить традиционные методы для расчета истинных значений констант связывания. Более надежные данные могут быть получены для моноклональных антител и их Fab-фрагментов, так как в этом случае могут быть выделены индивидуальные антитела в гомогенном виде.
Истинные значения констант связывания важны для определения термодинамических характеристик процесса взаимодействия • антиген — антитело. Для практических целей, в частности для разработки методов иммуноферментного анализа, достаточно знать эффективные значения, характеризующие свойства используемых антител.
Рассмотрим принципиальные подходы к определению констант равновесия. Из уравнения (3.3) следует, что для расчетов необходимо знать концентрации свободного и связанного с антителами антигена в условиях равновесия. Обычно для этого используют антигены, меченные маркером, который с высокой чувсти-тельностью может быть определен одним из доступных физикохимических методов.
Все методы, позволяющие определять концентрации свободного и связанного антигена, можно условно разбить на две большие
группы. К первой относятся методы, в которых стадия разделёния свободного и связанного антигена осуществляется путем избирательного осаждения, аффинного связывания (иммобилизации) или гельфильтрации. Если реагенты достаточно сильно различаются своими молекулярными массами и размерами, то процедура разделения существенно упрощается. В случае корпускулярных антигенов оставшиеся несвязанные антитела могут быть отделены либо центрифугированием, либо пропусканием смеси через фильтр, задерживающий антиген. Для низкомолекулярных антигенов (гаптенов) используется равновесный диализ.
Вторая группа включает методы, базирующиеся на изменении физико-химических свойств антигенов (или меток, связанных с антигеном) при комплексообразовании с антителами: тушении или усилении флуоресценции, изменении степени поляризации флуоресценции, ингибировании ферментативной активности.
Равновесный диализ — наиболее распространенный метод изучения реакции антиген — антитело. Метод основан на различной способности антител и гаптена проходить через полупроницаемые мембраны. Раствор каждого реагента известной концентрации в одром и том же растворителе с одинаковой ионной силой и значением pH помещают по разные стороны мембраны. Молекулы гаптена диффундируют в раствор антител и связываются с ними. При достижении равновесия концентрация свободного гаптена выравнивается по обе стороны мембраны. Измерив равновесную концентрацию гаптена, можно рассчитать количество гаптена, связанного с антителами, и определить по уравнению (3.3) константу связывания.
