Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
т-1=Л1([Аг] + [Ат]) + ^1. (3.39),
Величина т называется временем релаксации. Анализ зависимости в координатах 1 / т Ч-Ч-([ Аг]+[Ат]) позволяет найти по тангенсу угла наклона прямой значение k\, а по отрезку, отсекаемому на оси ординат, k-\ (рис. 15).
Определение констант скоростей комплексообразования с использованием меченых реагентов. Этот метод, нашел большое применение в связи с развитием высокочувствительных методов иммуноанализа, основанных на использовании меченых реагентов: радиоим-мунологического, иммунофер-ментного и других -методов. Кинетические закономерности простейшей схемы (3.38) взаимодействия антиген — антитело (моноклональные антитела — одновалентный антиген) описывает система дифференциальных уравнений:
L=?i[Ar][AT]—?_1[Аг.Ат].
Рнс. 15. Определение кинетических констант взаимодействия моновалентного антигена с субпопуляцней антител по методу температурного скачка
dt
¦ ky [Аг] [Ат] -|-k-x [Аг-Ат]; —[Аг] [Ат] +?-i 1 Аг • Ат].
(3.40)
С учетом уравнения материального баланса
[Ат]0=[Ат]4*[Аг• Ат]; [Аг]0=[Аг]4-[Аг-Ат] (3.41)
н начальных условий (^=0, [Аг-Ат]=0) можно получить решение системы
а + b _ --2JV
где a = Y(IArb+[ATlo+*-i/*i);
(^ША^--А-)г-[Аг|, [Ат],. (3.43)
Весьма существенным параметром в «ммуноферментном анализе является время установления равновесия в системе. Если считать, что t равн определяется условием [Аг-Ат]-[Аг-Ат]равн
= е, (3.44)
[Аг-Ат]равн
то время установления равновесия можно найти по формуле
(я — Ь) е Хт+f)]* ^ (3'45)
Так как для вычисления времени необходимо точное значение констант скоростей k\ и k-i, которые часто неизвестны, то это уравнение обычно используют лишь для самой грубой оценки времени установления равновесия.
¦Определение константы скорости ассоциации. 1. Наиболее простой метод основан на регистрации начальной скорости Ко образования комплекса Аг-Ат, тогда
—Уо/([Ат]0-[Аг]0. ' (3.46)
Однако метод недостаточно точен, так как определение [Ат]0 н V0 обычно производится с большой ошибкой. Для повышения точности при расчетах используют несколько начальных концентраций реагентов.
’ 2. Для нахождения k\ и-&_1 эксперимент проводят в условиях избыточной концентрации одного из реагентов. В случае применения меченого антигена используют большой избыток соответствующих антител. Выражение (3.42) для концентрации Комплекса в этом случае принимает следующий вид:
[Аг-Ат]— kl [а;?НАт]0 (i_|_e"(*l[Allo+*-i>') . (3,47)
[Ат]о + 1
Как видно из этого выражения, зависимость равновесной концентрации комплекса от времени описывается моноэкспоненциальной кривой с предэкспоненциальным множителем
(3.48)
соответствующим эффективной константе скорости ассоциации.
S3
Спрямляя зависимость (3.47) одним из известных способов, например, в координатах [Аг*Ат1
1п-------——--------------г t, (3.49)
[Аг-Ат],,, — [Аг-Ат]
по тангенсу угла прямой вычисляют k' при заданной концентрации [Ат] 0.
Откладывая графически k' от концентрации [Ат]0 (рис. 16),получаем прямую, тангенс угла наклона которой дает ki, а отрезок, отсекаемый на оси ординат, k~i. Данный способ расчета пригоден, когда &_1 сравнима с &i[Ar]0. В противном случае
*'=МАт10, (3.50)
что позволяет определить по тангенсу угла наклона только бимолекулярную константу скорости ki.
Определение константы скорости диссоциации. Обычно константу скорости диссоциации находят путем прямого измерения скорости процесса диссоциации. комплекса в условиях его необратимости. Для этого используют один из следующих подходов.
1. После установления равновесия в системе проводят разбавление системы большим избытком буфера. Так как скорость образования комплекса пропорциональна произведению концентраций каждого из реагентов, а скорость диссоциации комплекса — его концентрации в первбй степени, то при сильном разбавлении
”^днс ^ ^ас-
В этом случае процесс диссоциации комплекса Аг-Ат будет описываться экспоненциальной кривой. Спрямлением ее в логарифмических координатах можно получить константу скорости k-u
2. В систему вносят вещества, способные быстро и полностью связывать или удалять свободный лиганд. Если скорость удаления свободного лиганда будет существенно больше скорости диссоциации комплекса, то наблюдаемая скорость распада комплекса описывается реакцией первого порядка с k~\.
3. После установления равновесия в системе антитела — меченый антиген в нее вводят избыток свободного немеченного антигена. В этих условиях процесс изменения концентрации комплекса [Аг*-Ат] также описывается кинетикой первого порядка* константа скорости которого соответствует k-u
